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    我是顾少华,LorMe实验室的成员,今天是一个特殊的日子。

    5年的辛苦终于有了回报。博士期间的研究工作成果以“Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizosphere microbiomes”为题发表在国际著名学术期刊《Nature Microbiology》(IF2018=14.3)。该成果揭示根际微生物铁载体介导根际菌群与土传病原青枯菌互作,在作物健康中发挥了关键作用。

    其实不仅仅是文章发表本身,更重要的是从一个想法到团队协作,到取得突破,再到被国际专家认可的过程中,自己真实的成长,是值得开心的。

    借着这个机会,给大家分享一下我在LorMe这5年的研究经历(注意:内容>10000字)。

    第一章:初识铁载体

    2015年4月一个阳光明媚的午后,我的导师徐阳春教授把我叫到他的办公室,当我走进徐老师办公室时发现小导韦中老师也在。就是这个午后,两位老师跟我提出了铁载体的研究课题。我清晰的记得当时韦老师跟我介绍了铁载体是微生物分泌的一种高效螯合三价铁离子的低分子量化合物,根际铁载体可能在介导根际微生物-病原菌以及根际微生物-植物互作中发挥着重要作用,但这一点目前尚不明确,需要我去探究。徐老师说这个方向与植物营养学、土壤学、微生物生态学等都有交叉,是值得突破的点。

    那次谈话非常的简短,因为当时的我对铁载体可以说是一无所知,两位老师让我回去好好了解了解铁载体以及相关的研究背景。离开徐老师办公室后的我心情是复杂的,一方面我很庆幸可以得到两位老师的信任,将一个新的研究领域交给我去探索,另一方面我很害怕自己无法完成这个工作,因为我对铁载体几乎一无所知。不过,当时的我正好上完了研究生的所有课程,可以专心投入到自己的研究课题中了。

    确定了课题,去查阅资料我倒不担心。因为从研究生入学复试结束后,我其实就算进入LorMe实验室了。实验室对文献阅读要求很多,尤其是微生物生态、进化等相关的。在进入实验室的一年里,我常常认认真真的跟师兄师姐们学习和交流,然后通过大量阅读文献更加全面客观的掌握相关知识。我非常积极主动的参与到师兄师姐的实验中,在实验的过程中一方面掌握相关的实验技能,另一方面通过与师兄师姐的交流了解研究背景、研究内容和研究意义。通过一年的积累和学习,我对实验室的研究已经有了比较全面的掌握。

    不过当我在徐老师办公室听到铁载体时,却是如此陌生。这似乎不仅仅是我一个人的知识盲区,因为我走出徐老师的办公室,立马就去和实验室的师兄师姐们交流,他们只跟我说好像在文献中看到过siderophore(铁载体)这个名词,但都没有什么深刻印象。后面我又去打听整个大团队以及南农是否有专门做铁载体相关研究的人,可能是因为我交际圈的限制,我没有打听到一个专门做铁载体相关研究的人。此时的我开始意识到我未来的研究路上可能会比较孤独。但我偏偏是一个喜欢挑战的人,我喜欢接触新鲜事物,就这样,我开始了与铁载体五年的朝夕相处时光。

    第二章:熟悉铁载体

    首先介绍一下为什么我们要开展铁载体的研究。众所周知,由土传病原菌引起的作物土传病害是制约全球粮食优质高产和农业可持续发展的重要因素,其本质是不合理的集约化农业发展下土壤生态环境严重恶化、土壤微生物群落结构极度失衡和根际生态功能严重失调的必然结果。为恢复土壤微生物生态平衡,提升根际土壤生物功能,土壤学工作者需要阐明根际菌群-病原菌互作关系对土壤健康的贡献。LorMe实验室长期以细菌性病原青枯菌为模式病原菌,开展根际微生态与植物健康的研究。前期已从营养竞争、拮抗竞争两个方面详细论证了根际菌群内部竞争互作对植物健康有积极的意义,但我们很清楚土壤微生物之间不仅存在相互竞争的关系,也存在相互促进的关系。在开展根际菌群与土传病原菌互作研究中,韦老师一直有一个疑问?为什么病原菌单枪匹马能够成功入侵复杂的根际菌群?基于研究过程中的思考,韦老师认为土传病原菌作为土壤微生物中的一员,它能够在复杂的根际微生物环境中快速增殖,理论上有不少微生物提供了直接或者间接的帮助。土壤中除了有抑制病原菌的有益微生物,还可能有一些土壤微生物为病原菌的入侵提供了关键资源。而且提供的资源应该是微生物生长的必需品,并且在根际非常稀缺,因为,只有这样的资源才可能在复杂的根际菌群互作中发挥关键作用,进而影响根际健康。此外,如果根际微生物能提前占据这些稀缺资源,也可能会有效抑制病原菌的入侵。

    通过大量的文献阅读发现,我慢慢明白为什么要研究铁载体了。第一,铁作为细胞生长代谢不可或缺的元素,其生物有效性(Fe3+)在环境中很低,根际微生物对Fe3+的竞争利用非常激烈,这样铁就符合稀缺和必需的要求,而且在环境中的形态单一。不像碳和氮等营养资源,虽然重要但在环境中形态多样。第二,为了获得稀缺的生物有效性铁,微生物会产生一种可以结合Fe3+的铁载体,来争夺环境中的铁,这样就有一个共同的获得铁的工具,可以用统一的方法来检测铁载体的产生。第三,虽然铁载体是公共物品,但由于铁载体具有相对的特异性,有些微生物分泌的铁载体不能被其他微生物利用,就形成了微生物间的拮抗竞争作用;有些微生物的铁载体受体蛋白能识别其它微生物产生的铁载体,那么这类铁载体就作为公共物质被其他微生物利用,形成了微生物间的便利促进作用,这样符合根际微生物促进或者抑制病原菌入侵的假说需求。

    此外,关于铁载体的研究其实还蛮多的,一方面是偏应用的,往往是分离筛选有益微生物,铁载体产生作为一种促进植物生长的特性研究的,没有深入系统的探究;另一方面是偏生态和进化理论探究的,这部分往往聚焦在假单胞菌这个模式类群,铁载体结构以及相关基因突变体等信息和材料都比较完善,发表的文章也都非常好。还有一类是分析铁载体结构的,由于方法复杂,这类不多,主要是针对某些重要细菌来研究的。

    由以上分析可知,在群落层面上研究铁载体的作用可以说基本是没有的。说明我们选择的角度还是可以的。2015年8月,韦老师从国外给我打了一个QQ电话,说在一个国际会议上,看到有人在做大量细菌产生铁载体的研究。“从土壤和湖水中分离了几百株假单胞菌,非常有意思,文章还没有发表。我们根际微生物种类非常复杂,我们不能仅仅聚焦在假单胞菌,应选择更多类群才能有代表性,并且用几千个细菌,这样在未来几年工作发表时才可能有竞争力”。后来那个工作2017年发表在Nature Communications上,我认真的阅读了,的确是非常棒的工作。3年后我们的工作发表在Nature Microbiology上,证明韦老师这个决定是正确的。

    第三章:与铁载体的门外接触

    既然生物有效性铁非常有限,并且微生物主要通过产铁载体来争夺利用有限的铁,那么铁载体必然会影响群落互作关系,可推断微生物铁载体调控根际菌群与病原青枯菌的竞争或便利互作关系,进而影响病原青枯菌的入侵,这一问题并没有答案。第一,不清楚根际细菌是否都能产生铁载体,它们产铁载体的能力如何?也不清楚产生的铁载体到底对青枯菌生长有什么影响,哪些微生物产生的铁载体抑制了病原菌的入侵?哪些微生物产生的铁载体促进了病原菌的入侵?基于这些简单的小问题,我开始了我的铁载体研究之路。

    研究伊始,我和王孝芳开始了为期三个月的分离根际可培养微生物的工作。我们各自负责自己的研究课题,但是却通力合作,我负责分离根际土壤样品中的细菌;王孝芳负责分离根际土壤样品中的噬菌体、病原青枯菌(她的部分工作已经发表在了著名国际期刊Nature Biotechnology上)。在这里我要感谢一下王孝芳同学,和优秀的人在一起让我学习很多,我有一个习惯自我感觉还算不错,我比较善于发现别人身上的优点并进行学习,我坚信并笃行“三人行必有我师”。经过三个月的努力,我从番茄根际随机分离、纯化了2000多株根际细菌(图1)。在这里我要感谢LorMe的全体小伙伴,在纯化菌株的过程中得到了实验室全体小伙伴的鼎力相助,将2000多株根际细菌多次划线纯化这么大的工作量,没有实验室小伙伴的帮助,是不可能这么快就完成的。竞争求发展,合作谋共赢,在LorMe文化的熏陶下,这些大工程得到了顺利完成。

    分离、纯化根际细菌的平板( LorMe

    后来的16S rRNA基因鉴定结果显示,这次分离的细菌代表性还不错。主要隶属于4个门35个科和83个属,其中变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria),分别占细菌总分离数的50%、24%、18%和8%。几个丰度较高的属为芽孢杆菌属(Bacillus)、大肠杆菌属(Enterobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium),丰度分别占总细菌分离数的19%、15%和14%,这三个属的总比重达到了48%。

    辛苦了几个月,还在铁载体的门外。这些是不是根际细菌都能产生铁载体?产生量是否有差异?产生的铁载体对病原青枯菌生长有什么影响? 这些简单问题还没有回答。

    第四章:LorMe的团队力量

    问题简单,开展起来却不容易。我们需要得到2000多株根际细菌在限铁和富铁条件下的发酵液以及测定发酵液中铁载体的含量以及发酵液对青枯菌生长的影响,每个菌株还要有3个重复。经过详细的计算之后(准备培养基、分装到离心管、编号、摇种子液、编号、接菌、培养、编号、离心、编号、过滤、编号、分装、接菌。。。)*几千,我很沉重地告诉韦老师,“如果我一个人开展工作,可能需要一年不休息,完全占据实验室的几个设备,才可能把这个实验完成,而且还不知道结果如何”。

    韦老师可能注意到我的担忧和不安,他说他来安排,让我先准备各种实验材料。之后他开了一次实验动员会,把他所带的2013级本科学生(韦中老师为班主任)也召集过来。韦老师详细讲解了这个研究的重要性和挑战,并认真分析了实验流程,对任务进行了拆解,找到实验过程中的瓶颈问题。一次性配几十升培养基,准备几万的各种枪头、离心管、过滤器等已经不是难题。在计算分析的过程中,我们发现离心是个重大瓶颈,因为一个小离心机也就20个孔左右,一个离5分钟,一小时也就离100个样品,每天1000个样品,也要10个小时。离心只是一个小环节,不能卡在这里。后来就决定把整栋楼能借的小离心机都借过来,这样就保障2小时以内完成离心任务。最后,这次实验分了三批,用3个星期完成了。本次预实验的结果给了我很大的信心,简单的数据规律符合我们的初步预期,是我继续开展正式实验的基础。通过这次预实验的开展,我对整个实验流程和设计有了更加清晰的了解,也发现了一些可以改进的地方。韦老师也更新了实验设备,比如把培养、离心和过滤都在96微孔板体系操作,实验能可控,更省力省时省钱。后面重复这个实验时,我一个人再加上偶尔1-2个帮手,2个月也就完成了(高通量设备真的很重要,不然我肯定坚持不下去)。在此我感谢参与到本次实验中的所有人,尤其是已经毕业的2013级资环131班的同学,这次预实验能够如此高效的完成离不开你们每一个人的帮助。

    本科生和实验室小伙伴一起开展预实验的场景

    第五章:疯狂的战斗

    正式实验的开展是在2016年的暑假,因为那个暑假LorMe的大部分学生都去宜兴基地布置和开展温室盆栽实验了,所以留在学校的学生非常少。因此,这个暑假两个月的时间里,我几乎一个人占有了一整个实验室(B603实验室)。我深知自己的实验需要很大的实验室空间和占用很多的实验室资源,所以为了不影响别人实验的开展,这两个月是开展和完成我实验的最佳时间。我必需非常珍惜这样难得的两个月,因此这两个月我的实验安排的非常紧凑,几乎除了去学校食堂吃饭和晚上几个小时的睡觉时间外,我从未离开过实验室。徐老师的办公室就在实验室的斜对面,在暑期的两个月,徐老师几乎天天都会来实验室检查实验室安全问题,所以这两个月我和徐老师几乎天天可以碰面。我还清楚的记得,暑期结束后的第一次组会,徐老师表扬了我,打趣的说我耐得住寂寞,可以一个人静下心来在实验室如此高效的完成这样一个实验。

    根际分离细菌发酵液对青枯菌影响实验的96孔板

    我们用CAS法测定2000多株根际细菌分泌的铁载体的相对含量,结果显示高达95%的根际分离细菌产生了铁载体,并且在限铁条件下铁载体产量明显提高。限铁条件下根际细菌产生的铁载体能力与其生长能力正相关,但在富铁条件下不相关。这些结果表明,铁载体的生产是根际细菌间存在的普遍现象,并且对于限铁条件下的细菌生长很重要。随后,我们评估了来自不同菌株的铁载体对病原青枯菌生长的影响。我们首先将从富铁条件下收集的细菌无菌发酵液(不含或者仅含少量铁载体,主要含有除铁载体以外的其他代谢产物)添加到富铁条件下去培养青枯菌,我们发现这些发酵液对青枯菌生长的作用比较温和,且以促进作用为主。而将根际细菌在限铁条件下得到的无菌发酵液(含有大量的铁载体和其他代谢产物)加入限铁条件下去培养青枯菌时,我们发现这些发酵液对青枯菌的生长具有更为强烈的影响(抑制或者促进),这些影响的范围从几乎完全抑制到高水平的促进作用。为了验证观察到的富铁和限铁条件之间的生长效应差异是否确实是由铁载体而不是由其他代谢产物变化引起的,进一步将2000多株根际细菌在限铁条件下得到的发酵液补足铁(铁载体被螯合),并将补足铁的发酵液加入到富铁条件下培养青枯菌,在此条件下由于铁充足,铁载体无法发挥作用,因此主要是其他代谢产物介导的作用。研究发现,限铁条件下其他代谢产物介导的根际细菌对青枯菌的作用和富铁条件下发酵液介导根际细菌对青枯菌的作用无显著差异,这表明铁载体是铁限制条件下细菌相互作用的主要驱动力。确实,当估计铁载体的净效应时,我们发现铁载体解释了发酵液介导的对青枯菌的总生长效应的76%。有了这个结果,整个项目就可以继续推进了。

    根际分离细菌在限铁和富铁条件下铁载体的产生情况(a)以及铁载体产量与根际细菌生长之间的相关性(b);不同铁素处理下根际细菌发酵液以及铁载体对青枯菌生长的作用(c)和限铁条件下铁载体和总代谢物质介导的根际细菌对青枯菌生长的作用之间的相关性(d)

    这里还是补充一点,其实数据分析没有那么顺利。之前埋头做实验,数据分析少,一下子面对这么大的数据,我其实非常头大:拿到实验数据,不知道怎么分析,R语言不熟。韦老师问我结果呢,我说还在分析,找不到突破点。后来韦老师着急了,喊我带着数据到他办公室。大概半个小时吧,他把一个相关性分析结果展示给我看,铁载体产生与对青枯菌生长能力影响。“看到这个现象就行了,可以继续推进工作了”。

    第六章:战斗之后的迷茫

    “科学问题简单,试验本身简单,甚至是单调的重复,数据量大不好分析,工作的重要性把握不准,工作方向摸不清楚。”后来一次组内交流中,韦老师以我的工作和研究生交流了一下。他说,这时候研究生容易有思想波动,需要适当的心理建设。最重要的法宝是反复和大家交流工作的意义,研究的思路,让研究生从内心深处认可自己的工作,并为之努力。

    我的经历就是典型案例。

    研究思路可能对于韦老师来说是清晰的,其实我那时开始进入研究的瓶颈期,这应该持续至少半年时间。这半年我开始陷入自己的思想误区(【LorMe特刊】不要陷入自己的思维怪圈里),开始对自己的研究感到陌生和迷茫,最可怕的地方是我开始排斥和导师交流了。现在分析之所以排斥和导师交流或者对自己的研究感到迷茫,主要原因是自己的研究思路没有打开,不知道该跟导师交流什么,因此产生了逃避心理。虽然内心有所逃避,但我并没有浑浑噩噩的度日,我依然在大量阅读相关文献,试图打开自己的思路。但我已然进入了自己的思想误区,现在的我很明白,如果没有韦中老师的引导,我很难靠自己走出来。我能打开自己的思路,还离不开两位外国学者的耐心指导,他们分别是荷兰乌特勒支大学的Alexandre Jousset博士和英国约克大学的Ville-Petri Friman博士。韦老师多次让我将研究思路和已有的研究结果与两位外国学者进行交流,在交流的过程中他们根据已有的结果给了我很多指导建议,并且肯定和完善了我们的研究思路。这次交流让我深刻的意识到学术交流的重要性,不管在研究的过程中遇到怎样的问题,一方面是自己的独立思考,另外一方面一定要积极主动的和导师或者其他研究学者交流,从不同的角度评估自己工作的不足和工作的亮点。我认为独立思考固然重要,但交流的重要性并不比独立思考低,因为别人的一句话可能如醍醐灌,让你顶豁然开朗。虽然徐老师和韦老师以及两位外国学者对我的指导和帮助伴随着我整个研究生生涯,但这段时间的指导对我显得格外深刻。

    Alexandre Jousset博士和Ville-Petri Friman博士

    第七章:柳暗花明

    虽然有些迷茫,但是还是坚定地跟着导师走,做一些简单数据分析工作。比如哪些分类地位的细菌产生的铁载体多,哪些细菌产生的铁载体对青枯菌是抑制或者促进作用?是否存在一些遗传驱动机制?慢慢的数据分析能力提升了,找到了一些有意思的现象。比如大肠杆菌属(Enterobacter)和金黄杆菌属(Chryseobacterium)总体产生铁载体的能力特别强,对青枯菌也有很强的抑制能力,而芽孢杆菌属(Bacillus)总体产铁载体能力弱,对青枯菌生长也总体是促进作用。分析到这里也吓我一跳,因为这个跟之前的常识有些不太一样。大家之前都说芽孢杆菌是有益微生物,能抑制病原菌,而我的研究发现大部分芽孢杆菌都有可能促进病原菌生长(产生的铁载体能被病原青枯菌利用,间接成为病原的帮凶)。不过这一结果也恰恰说明了微生物的世界很复杂,我们的了解还太少。

    我们检查了细菌分类学的隶属关系是否可预测铁载体的生成以及铁载体介导的对青枯菌生长的作用。研究发现发现两种性状均具有显著的系统发生信号(铁载体产生的Cmean:0.262,铁载体介导的对青枯菌生长作用的Cmean:0.148,两种性状的p <0.001),该信号相对较弱(Cmean = 1表示所有观察到的变异由系统发育学解释),这表明在相关根际分离细菌之间铁载体的产生和铁载体介导的作用均可能存在差异,这些差异可能是由于最近的变化、性状功能的获得或丧失导致的。对18个最常见属的集中分析证实,共同祖先和属内差异均会导致性状变异:(a)某些属(例如比较肠杆菌和芽孢杆菌)在铁载体的产生及其对青枯菌生长的影响程度上存在属间差异;(b)这两个性状的属内(例如芽孢杆菌属)分离株之间的变异也很大。我们将根际细菌与青枯菌的系统发育距离和铁载体产生用于综合预测铁载体介导的根际细菌对青枯菌生长的作用,发现抑制作用最强的是与青枯菌系统发育距离相对较近并产生大量铁载体的分离株。这种系统发育效应与生态学理论相一致,生态学理论中强调,密切相关的物种之间因为生态位的重叠的可能性更高,因此资源竞争更剧烈

    根际分离细菌分类地位与铁载体产生及作用之间的关系(a);18个丰度较高属的根际分离细菌铁载体产生和作用情况(b);根际分离细菌与青枯菌之间的系统发育距离、铁载体的产生以及铁载体介导的作用之间的关系(c)

    第八章:啃下硬骨头

    前面我们明确了铁载体对根际细菌和青枯菌生长的影响,但都是用发酵液来研究的,但是这些结果是否能够解释根际细菌与病原青枯菌共存时的规律呢?这是理论与实际结合的最关键步骤。

    第一步是实验共培养实验,工作比较简单,就是工作量大。我们分析了限铁共培养条件下2150个根际分离细菌与青枯菌之间直接竞争的结果。我们发现如果根际细菌产生抑制性铁载体,共存时青枯菌生长的就差;如果产生便利型铁载体,共存时青枯菌生长的就好。由于根际细菌种类复杂,很难检测所有细菌在共存时的丰度,韦老师建议重点以芽孢杆菌为例,看看芽孢杆菌在与青枯菌共存时的变化。同样我们发现如果芽孢杆菌产生抑制性铁载体,其自身生长就好一些,反之就生长的差。对这一结果的合理解释是铁载体介导的效应决定了根际细菌与青枯菌的铁素竞争力,当铁载体介导促进效应时,根际细菌的铁素竞争力弱,分泌的铁载体被青枯菌剥削利用,促进了青枯菌的生长,而自身分泌铁载体消耗了大量的能量却无法回收自己的铁载体获得铁素营养,因此生长受阻;而铁载体介导抑制效应时,根际细菌的铁素竞争力强,分泌的铁载体将环境中微量的铁素营养固定住,供自己使用,可以保障自己更好的生长,而青枯菌利用铁素营养受阻,生长受到抑制

    那么这一效应是否可以解释田间根际细菌和青枯菌的共存模式呢?如果可以也是一个重大突破,因为把室内工作与田间现象关联了起来。我们使用了整个微生物组群落的16S rDNA测序和qPCR来估计每个根际分离细菌与青枯菌在80个土壤样本中的共存能力。我们发现,产生抑制作用铁载体的根际细菌趋向于与青枯菌具有强共存能力(根际细菌丰度与病原菌数量呈正相关),而产生促进作用铁载体的根际细菌与青枯菌的共存能力较弱。这一发现也让很多人吃惊,包括审稿人也让我们再解释清楚一些。一般认为竞争结果是一个受益(种群数量增加),一个受损(种群数量下降),负相关应该是体现竞争关系,但是这里为什么说便利促进效应呢?根际细菌丰度与病原菌数量呈正相关为什么是根际细菌共存竞争能力强呢?我也是在韦老师的反复解释下明白的:青枯菌的入侵,以及种群数量的激增是有寄主优势的,没有强大的外力和前期及时的扼杀,病原菌种群数量增加是不可逆的。病原菌种群数量的激增必然需要大量资源的支撑,C和N等资源土壤-植物系统可以提供,但是稀缺的必须元素铁只有争夺。只有产生铁载体能力强,并且产生的铁载体不能被激增的病原菌群体利用,这样的根际细菌种群才能在根际中利用C和N等其他资源,进而保持较高的种群数量。那些产生能被病原菌利用的铁载体的细菌,只能被剥削,消耗了自己的能量,铁载体被激增的病原菌种群利用,种群数量自然很低。所以与病原菌种群数量的正相关,正是说明根际细菌的强共存竞争能力。此时我们明确了铁载体是根际细菌与病原菌争夺根际核心稀缺资源铁素的秘密武器

    室内限铁条件下根际细菌与青枯菌共培养时青枯菌的生长与铁载体介导的作用之间的关系(a);田间条件下铁载体介导的作用与根际细菌与青枯菌共存能力之间的关系(b)

    第九章:最后一战

    那么这些强共存竞争能力的细菌是否可以为我所用,保护植物健康呢?这个问题正是我要最终回答的。做完这个,我就可能找到对付土传青枯病的一些办法。

    2018年,我在有机固体废弃物资源化协同创新中心(宜兴)完成了这个工作。这又是一个大工程,360个根际细菌,几千棵番茄。温室盆栽实验保质保量的完成离不开LorMe成员的帮助,我们几乎所有的实验都是全员出动,共进退,互帮互助。那一年暑假我的工作量是最大的,尽管别的学生也有很重的实验安排,但几乎所有当年的新生(没有自己的实验安排)主要都是在协助我开展温室盆栽实验。徐老师在宜兴指导我们工作的时候特别强调温室盆栽实验的水分管理至关重要,一定要尽量保证每棵苗的土壤水分保持一致,因为水分对实验结果的影响很大。这就要求我们浇水的时候要特别细心,一棵苗一棵苗的进行定量浇水,一个人负责10车必然不能做到良好的水分管理,于是我给新生布置了任务,加我一起五个人,每个人负责2车的水分管理。尽管如此每天晚饭后去浇水,我们几乎每次都需要花费一个小时的时间。温室出现第一颗发病植株后,我们还需要每天记录温室的发病率,加上每隔三天我们需要将盆栽随机打乱位置,所以几乎每天都会有一群人在夜深的时候行走在温室回工程中心的路上。我清晰的记得温室实验结束的那一天,我们全体在宜兴的LorMe成员采集和整理我温室盆栽实验的根际土壤样品,从早到晚除了吃饭时间一刻也没有休息,一直奋斗到凌晨1点才回宿舍休息。这些日子显然是辛苦的,但是回忆却是如此的美好,再次感谢所有一起在宜兴奋斗过的小伙伴。

    温室实验得以顺利完成也离不开宜兴沈主任的无私帮助,沈主任负责管理宜兴所有的学生,他经常发动学生进行协同合作,哪个学生有需要,只要跟沈主任说一下,主任就会组织安排学生进行互帮互助。沈主任不仅仅只是负责安排,他总是亲自带头上阵,在温室经常可以看到主任忙碌的身影,今天帮这个学生,明天帮那个学生,沈主任这一优秀品质深深的感染着我。沈主任经常跟我讲,一定要学会团队合作,一个人的力量是薄弱的,但是团队的力量是惊人的,在宜兴的2个多月的时间里,沈主任的言传身教,让我学习很多,受益匪浅。

    温室盆栽实验10车番茄植株,我和沈主任(右)在温室合影,徐老师在温室指导学生

    温室盆栽实验的结果显示,铁载体介导的相互作用与青枯菌生长和植物保护均显著相关。具体而言,当预先接种的根际分离细菌产生促进性铁载体时,病害发生率和根际青枯菌数量较高,而当植物预先接种的根际分离细菌产生抑制性铁载体时,病害发生率和根际青枯菌数量较低。此外,根际青枯菌数量与病害发生率呈正相关,表明抑制青枯菌生长在病害防控中起关键作用。尽管本研究发现的关联都很重要,但我们必须要意识到它们仅解释了所观察到的总变异的相对较低水平。这表明除铁载体以外的其他因素也影响病原菌的侵染结果。总而言之,我们的温室实验与体外和田间观察到的青枯菌生长以及根际细菌与青枯菌的共现模式均非常匹配,表明铁载体介导的作用可以预测根际细菌对病原菌的抑制和病害的发生情况。

    铁载体介导的作用与感病成功与否(a)、感病程度(b)和根际青枯菌的数量(c)之间的关系;根际青枯菌数量与感病成功与否之间的关系(d)

    第十章:写在最后

    到这里,我的研究生课题工作就差不多了。在后期的数据分析、论文撰写过程中我也提升很多。这里还想特别感谢另外两位在我科研路上给予我极大帮助与支持的外国学者,他们是瑞士苏黎世大学的Rolf Kümmerli教授和Jos Kramer博士,这两位学者在假单胞菌铁载体介导的微生物生态和进化方面拥有丰富的研究经验和扎实的研究基础,在系统发育分析和论文写作等方面,他们给我提供了很多的指导和帮助。2017年当Rolf的Nature Communications文章发表时,听韦中老师说,Rolf就是他2015年在欧洲进化生物学会议上认识的,当时只握了一下手,告诉Rolf未来几年会开展铁载体相关的工作,希望有机会再请教他。三年后,韦老师在欧洲访学期间,在国际微生态大会再次与Rolf碰面交流,之后又专程跑去苏黎世大学与他进行了面对面的交流,建立了良好的合作基础。韦老师说,铁载体对我们来说是一个新的领域,跟最棒的人学习才能进步的快。

    Rolf Kümmerli教授和Jos Kramer博士

    铁载体的发现感觉就像宝藏挖掘的过程,前面很长一段路都非常苦,而且看似都没有希望。但你必须不断的坚持,不断的更新学习和交流,才可能在不熟悉的领域闯出一条路,拿到宝石。

    不要忽视平台的力量,不要孤军奋斗,我深知我的收获离不开多方面的支持;有时也必须学会独自战斗,自己没有蜕变,是无法体会收获的喜悦的。

    引用韦老师2020年1月对我的一个总结,“2015年开始铁载体工作,2年后少华还在晕乎乎,2018年才开始明白,2019年已经很棒了,2020年他基本准备好了”。我觉得总结的非常到位,我想也只有在整个过程中悉心陪我走下来的老师才有可能做到这个精确的总结。我的铁载体研究生涯才刚刚开始,马上要步入一个新的阶段,我会带着研究生期间的所感所悟,努力前行。

    感恩学校、学院的培养,感恩土壤微生物与有机肥团队大平台老师的关心和指导,感恩LorMe,感恩徐阳春老师,韦中老师,所有帮助我的同学和朋友以及我的家人。

    LorMe集体照片

    顾少华个人简介

    顾少华,男,29岁,江西上饶人。2014年6月毕业于湖南农业大学,南京农业大学2014级硕博连读生,主要开展铁载体与根际微生态相关工作。2017年在南京农业大学直博生论坛中表现优异获得研究生院的短期访学项目资助,前往美国威斯康星大学短期交流。2018年获得江苏-英国高水平大学20+20行动计划定制项目资助,前往英国约克大学短期访学。2019年获得南京农业大学博士论文创新工程,一等资助。博士期间发表第一作者文章两篇:Nature Microbiology和mSystem(小修)。

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    【SBB】土传青枯菌的入侵破坏了番茄根际微生物区系(SBB)

    【Ecology Letters】 土著微生物菌群间的“便利关系”也为病原菌入侵植物提供“便利”

    编辑|顾少华、韦中

    排版|尹悦

    校对|LorMe团队

    封面|张耀予

    南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队

    微生态与根际健康实验室

    Lab of rhizosphere Micro-ecology

    立足国家需求,探索学科交叉,引领国际前沿

    开展微生态研究、致力于根际健康提升、培养一流创新人才

    竞争求发展,合作谋共赢Competition & Cooperation

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  • 虽然目前研究中已经对部分菌株产铁载体的能力进行了检测,但由于尚未开发一种高通量的铁载体检测方法,我们对根际微生物铁载体产生能力的整体认知依旧缺乏。本文分别从不同地区选取番茄植株,采集根际样品,从中分离...

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    根际细菌产铁载体能力的高通量检测

    High-Throughput Detection of Siderophore Production of Rhizobacteria

    顾少华,万文,邵正英,韦中*

    农业资源与环境微生态与根际健康实验室,资源与环境科学学院,南京农业大学,南京,江苏

    *通讯作者邮箱: weizhong@njau.edu.cn

    摘要:据报道几乎所有的已知细菌都具有生产铁载体的能力,铁载体对于根际细菌获取铁素营养至关重要。虽然目前研究中已经对部分菌株产铁载体的能力进行了检测,但由于尚未开发一种高通量的铁载体检测方法,我们对根际微生物铁载体产生能力的整体认知依旧缺乏。本文分别从不同地区选取番茄植株,采集根际样品,从中分离出大量可培养根际细菌,并利用16s rRNA测序技术对其鉴定分类。利用96孔板酶标仪、酶标板离心机、手动96孔板移液器和自动移液工作站,通过CAS (铬天青) 检测法实现了对所有根际分离细菌铁载体相对产量的高通量测定。借此高通量检测方法可以对植物根际细菌产铁载体能力有个整体的认知。

    关键词: 植物,根际细菌,铁载体,CAS检测法

    材料与试剂

    1.胰蛋白胨 (OXOID,TRYPTONE,LP0042)

    2.大豆蛋白胨 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,69047737)

    3.氯化钠 (南京化学试剂有限公司)

    4.琼脂 (福建省金燕海洋生物科技股份,乘风)

    5.磷酸氢二钾 (南京化学试剂有限公司)

    6.七水合硫酸镁 (南京化学试剂有限公司)

    7.丙三醇 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,10010618)

    8.酪蛋白氨基酸 (DSLAB,18A0050)

    9.氯化铁 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,10011918)

    10.铁螯合剂2,2'-Dipyridyl (南京化学试剂有限公司)

    11.Tris-盐酸 (1 M Tris-HCl,pH=6.8,BL514A,100 ml)

    12.明胶 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,10010328)

    13.DNA试剂盒 (QIAGEN,DNeasy PowerSoil Pro Kit)

    14.引物F27 (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3',生工)

    15.引物R1492 (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3',生工)

    16.铬天青 (Fluka,Chromeazurol S,72687-25G)

    17.十六烷基三甲基溴化铵 (VETEC,V900413-100G)

    18.无水哌嗪 (Piperazine,Reagentplus 99%,Sigma-ALDRICH)

    19.Master mix(Vazyme,2x Taq Master Mix(Dye Plus),P112-AA)

    仪器设备

    1.自动移液工作站 (TECAN,Freedom EVO-2 100 Base)

    2.96道手动移液工作站 (苏州中析仪器有限公司,中析,SC9000)

    3.酶标板离心机 (湖南赫西仪器,台式低速离心机,TD5A)

    4.恒温摇床 (MIN QUAN,MQD-BIR)

    5.PCR仪 (life technologies,Applied Biosystems PCR热循环仪)

    6.酶标仪 (SpectraMax M5, Sunnyvale, CA, USA)

    7.96孔板 (96 well costar clear)

    8.-80 ℃冰箱 (海尔,立式超低温保存箱,DW-86L626,2013款)

    9.离心机 (Eppendorf AG,22331 Hamburg,5424EH062551)

    10.移液枪 (Eppendorf Research plus)

    11.一次性培养皿 (江苏康健医疗用品,90 mm)

    12.高压灭菌锅 (日本,鸟取,Tega SANYO Industry Co., Ltd,mlS-3780)  

    13.恒温恒湿培养箱 (新苗,隔水式电热恒温培养箱,GNP-9080BS-III)

    14.天平 (sartorius BSA2202S)

    15.涡旋仪 (SCIENTIFIC INDUSTRIES, USA)

    16.96孔板0.22 μm滤膜 (Millipore®,MultiScreenHTS GV Filter Plate, 0.22 µm, clear, sterile,MSGVS2210)

    软件和数据库

    1.NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)

    2.RDP (http://rdp.cme.msu.edu/)

    3.R 3.1.2 program (www.r-project.org)

    实验步骤

    1.植物根际土样的采集

    1.1根际土壤样品采集自番茄种植区,根据土壤在植物根系表面抖落和粘着的程度来区分根际土和非根际土,即人工轻轻抖落下来的土壤视为非根际土壤,粘附在根系表面的土壤为根际土 (Hu等 ,2016) 。 (注:这里以番茄为例,同样适用于其他植物)

    2.根际细菌的分离、纯化

    2.1取1 g根际土与9 ml SM缓冲液混合于50 ml的三角瓶

    2.2将三角瓶至于摇床中,转速为170 rpm,温度为30 ℃。

    2.330 min后使用无菌水将土壤悬浊液稀释至10-5-10-6,吸取100 μl稀释土壤悬浊液加入含有1/10倍稀释TSA培养基的培养皿中涂布均匀。在恒温 (30 ℃) 培养箱中避光培养48 h。

    2.4使用无菌牙签对每个样品进行随机挑取,每个植株选取32个单菌落,在TSA培养基进行划线、纯化。

    2.5挑取纯的单菌落分别于含有100 μl TSB培养基的96孔板中,将孔板放入摇床 (30 ℃,170 rpm) 中孵育过夜。

    2.6加入100 μl 30%甘油并充分混合,然后保存于-80 ℃冰箱。

    3.根际细菌的鉴定

    3.1使用16S rRNA扩增子测序从分类学上鉴定了2150个根际分离细菌。分别将单个细菌分离株过夜培养,利用试剂盒 (见材料与试剂) 提取总基因组DNA。

    3.2使用通用引物F27 (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') 和R1492 (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3') 通过PCR扩增16S rRNA基因。PCR反应 (25 μl) 包含1 μl细菌DNA,12.5 μl Master mix,正向和反向引物各1 μl和9.5 μl去离子水。PCR操作如下:首先在95 ℃预热5 min,后进入循环,在94 ℃变性30 s,在58 ℃退火30 s,在72 ℃延伸1 min 30 s,共30个循环。最后在72 ℃下延伸10分钟。

    3.3PCR扩增产物由上海生物工程技术有限公司纯化后测序。

    3.4使用NCBI和RDP数据库以及同源序列相似性鉴定16S rDNA序列,确定分离菌株的物种信息。

    图1. 番茄根际细菌的分离与鉴定示意图

    4.根际分离细菌产铁载体能力测定

    4.1将菌种活化,从-80 ℃冰箱中取出保存的甘油菌种,利用手动移液工作站转移5 μl甘油菌种至一个新的96孔板,每孔含有195 μl TSB培养基,于170 rpm 30 ℃摇床中培养过夜。

    图2. 96道手动移液工作站

    4.2随后转移10 μl培养过夜的菌悬液加入到分别含有190 μl MKB限铁培养基和MKB富铁培养基的96孔板中。将限铁和富铁培养基中的根际分离细菌于170 rpm 30 ℃的摇床中培养48 h。

    4.3将这些菌悬液用酶标板离心机离心,900 x g,离心5 min。

    4.4取上清液用96孔板滤膜 (0.22 μm) 过滤,得到无菌上清液。

    4.5采用CAS法进行铁载体产量测定,CAS法测定原理是基于铁载体对 Fe(III)的高亲和力,通过螯合作用产生的显色反应进行检测。金属铬天青(CAS)为一种金属滴定指示剂,其水溶液为红色,而 CAS 反应液中的 CAS-Fe3+-HTDMA 络合物则为蓝色,当溶液中有铁载体存在时,铁载体会竞争性结合络合物中的Fe3+,破坏络合物,游离出铬天青,溶液颜色由蓝色变为橙红色或粉红色。最后通过在 630 nm 波长下数值的改变对铁载体进行定性、定量研究。详细步骤为:利用自动移液工作站1:1添加CAS检测液至无菌上清液中,静置反应2 h,用酶标仪测定OD630,得出来的值为A;用没有培养过微生物的无菌培养基作为对照,和CAS检测液1:1混合,静置反应2 h,同样用酶标仪测定OD630,得到的值为Ar。铁载体相对含量 (SU) 的计算公式为:SU=1-A/Ar (Schwyn and Neilands ,1987) 。

    图3. 自动移液工作站

    4.6为了消除CAS测定方法产生的背景值,按照上述实验步骤检测了两种已知产铁载体的菌株 (Pseudomonas aeruginosa PAO1 和 Burkholderia cepacia H111) 及其相应的铁载体缺陷型突变株 (铁载体非生产者P. aeruginosa PAO1pvdDpchEF 和 B. cepacia H111orbJpchAB) (Ghysels等 ,2005, Sathe等 ,2019) 在限铁条件下的铁载体产量。然后使用两个铁载体缺陷型突变株的CAS测定值的平均值作为检测背景值和铁载体生成之间阈值的分界线。

    图4 . CAS法测定根际分离细菌产铁载体能力示意图

    结果与分析

    1.根际细菌分离结果:

    1.1接近16%随机挑取的单菌落无法在TSA平板中划线单独生长,最终从80个根际土样中分离得到2150株纯化后的菌株。

    2.菌株鉴定结果:

    2.1基于16s rRNA的系统发育分析结果显示,分离得到2150株根际细菌主要隶属于4个门,分别为变形菌门 (Proteobacteria) 、厚壁菌门 (Firmicutes) 、拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和放线菌门 (Actinobacteria) ,分别占细菌总分离数的50%、24%、18%和8%。隶属于35个科和83个属,其中几个丰度比较高的属分别为芽孢杆菌属 (Bacillus) 、大肠杆菌属 (Enterobacter) 、金黄杆菌属 (Chryseobacterium) ,丰度分别占总细菌分离数的19%、15%和14%,这三个属的总比重达到了48%。鉴定结果表明,分离的根际细菌覆盖了植物根际通常存在的主要细菌类群 (图5) 。

    图5. 2150株根际分离细菌的多样性和分类

    3.根际细菌铁载体产量的测定结果:

    3.1采用CAS 法对所有分离得到的2150株根际分离细菌上清液中的铁载体进行检测。由于上清液中可能存在一些有机酸和其他对铁具有低结合能力的分泌物对CAS的检测值会产生阳性干扰。为了在一定程度上消除这些背景值对CAS法检测结果的影响,按方法中所述,在对所有菌株检测的过程中增加了两株已知高产铁载体菌株和它们对应的铁载体缺陷型突变体的CAS检测,在限铁条件下培养48 h后这四株菌的上清液的CAS检测结果如图6A,两株野生型菌株的铁载体产量均在0.75以上,而它们对应的两株相同基因型的突变菌株虽然都不产铁载体,但CAS检测值却仍分别有0.29和0.26。

    3.2因此,选取两株非铁载体生产菌株的平均值0.275作为CAS检测的背景值,用于 矫正根际细菌铁载体产量,区分铁载体生产菌株和非生产菌株。结果显示,限铁条件下约95%的根际分离细菌可以分泌铁载体;而富铁条件下绝大多数根际细菌不分泌铁载体,但是仍存在少部分菌株依然可以分泌铁载体 (图6B) 。

    图6. 根际细菌分别在富铁和限铁情况下铁载体产量

    失败经验

    1.MKB培养基配置过程中所有用品,包括盛放的玻璃瓶、量筒、玻璃棒以及称量勺等都需保证无铁操作,其中玻璃瓶、量瓶等容器需用盐酸浸泡过夜,以去除瓶中原有的铁,使用时用大量纯水洗至容器中无残留的盐酸,避免盐酸的残留影响实验结果。

    2.MKB培养基、CAS检测液都需分开配制与灭菌,用时混合。

    溶液配方

    1.TSB培养基:胰蛋白胨15 g L-1,大豆蛋白胨5 g L-1,氯化钠5 g L-1,pH 7.2,115 ℃灭菌30 min。

    2.TSA培养基:胰蛋白胨15 g L-1,大豆蛋白胨5 g L-1,氯化钠5 g L-1,pH 7.2,15 g L-1琼脂条,115 ℃灭菌30 min。

    3.MKB限铁培养基:

    3.1首先分别配制以下三种溶液:

    1) 酪蛋白氨基酸50 g,甘油 (丙三醇) 15 ml加去离子水785 ml

    2)磷酸氢二钾2.5 g溶于100 ml去离子水中

    3)七水合硫酸镁2.5 g溶于100 ml去离子水中

    3.2分开配制完成后,分别独立灭菌,115 ℃灭菌30 min,pH 7.2,用时将3.1中的①②③全部混合。

    4.MKB富铁培养基:MKB限铁培养基中加入1 mM氯化铁储备液,氯化铁终浓度为50 μmol L-1 氯化铁。

    5.SM缓冲液:七水硫酸镁2.0 g L-1,氯化钠5.8 g L-1,1 mol L-1 Tris-盐酸 (pH 7.5) 50 ml L-1,2 % 明胶5 ml L-1,121 ℃高压灭菌20 min,4 ℃保存。

    6.CAS检测液:

    6.1首先分别配制以下四种溶液:

    1)1 mM氯化铁储备液:0.2703 g六水合氯化铁溶于一升10 mM盐酸中;

    2)CAS储备液:0.2421 g CAS (铬天青) 溶于200 ml去离子水中;

    3)HTDMA溶液 (十六烷基三甲基溴化铵) :称取0.0219 g HTDMA溶于50 ml水中;

    4)哌嗪缓冲液:称取4.3079 g无水哌嗪溶于30 ml水中,用盐酸调pH至5.6。

    6.2配制完成后取1.5 ml 溶液①加入7.5 ml溶液②混匀,边搅拌边加入50 ml ③,再加入30 ml ④,最后加入去离子水,最终配成100 ml CAS检测液。

    致谢

    本研究由国家自然科学基金 (41922053,41807045,31972504) ,江苏省自然科学基金 (BK20180527,BK20170085) 资助,依托于南京农业大学资源与环境科学学院微生态与根际健康实验室 (LorMe) 顺利完成这项实验。该实验方案摘自顾少华毕业论文及发表的文章 (Gu等 ,2020)

    参考文献

    1.Ghysels, B., U. Ochsner, U. Mollman, L. Heinisch, M. Vasil, P. Cornelis and S. Matthijs  (2005) . The Pseudomonas aeruginosa pirA gene encodes a second receptor for ferrienterobactin and synthetic catecholate analogues. FEMS Microbiol Lett 246(2): 167-174.4.

    2.Gu, S., Z. Wei, Z. Shao, V. P. Friman, K. Cao, T. Yang, J. Kramer, X. Wang, M. Li, X. Mei, Y. Xu, Q. Shen, R. Kummerli and A. Jousset (2020) . Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizosphere microbiomes. Nat Microbiol 5(8): 1002-1010.1.

    3.Hu, J., Z. Wei, V. P. Friman, S. H. Gu, X. F. Wang, N. Eisenhauer, T. J. Yang, J. Ma, Q. R. Shen, Y. C. Xu and A. Jousset (2016) . Probiotic Diversity Enhances Rhizosphere Microbiome Function and Plant Disease Suppression. mBio 7(6).3.

    4.Sathe, S., A. Mathew, K. Agnoli, L. Eberl and R. Kummerli (2019) . Genetic architecture constrains exploitation of siderophore cooperation in the bacterium Burkholderia cenocepacia. Evol Lett 3(6): 610-622.5.

    5.Schwyn, B. and J. B. Neilands (1987) . Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Anal Biochem 160(1): 47-56.2.

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    铁载体对根际细菌互作效应的介导作用研究方法

    Research Method of Siderophore Mediating Effect on Rhizosphere Bacteria Interaction

    顾少华1,万文1,邵正英1,韦中1 *

    1农业资源与环境微生态与根际健康实验室,资源与环境科学学院,南京农业大学,南京,江苏

    *通讯作者邮箱:weizhong@njau.edu.cn

    摘要:植物根际因其特殊的理化条件孕育了种类繁多、功能不同的根际细菌,它们之间或为互帮互助,或为拮抗竞争,都对植物的生长与健康产生了重大的影响。以土传病原菌青枯菌为例,根际有益菌可以通过营养竞争抑制病原青枯菌的生长,从而达到减轻病害的目的。而在有益菌与病原菌的营养竞争中,作为细菌在限铁条件下利用铁的关键物质的铁载体发挥着重要功能,因其对三价铁的高亲和力和特异性的特点,对限铁条件下有益菌、病原菌的生长都具有显著作用。但在以往的研究中,往往难以区分铁载体和其他代谢物质介导的作用,因此,本方法通过建立了三种不同类型的根际细菌上清液处理,即富铁、限铁、补铁,培养病原青枯菌,通过补铁消除铁载体效应得到其它代谢物质介导的根际细菌对病原青枯菌的作用,同时通过比较限铁和补铁的作用最终评估出铁载体单独介导的根际细菌对病原青枯菌的作用。结果表明,铁载体是根际细菌与青枯菌互作的重要影响因子,为铁载体介导的其他根际细菌间的相互作用提供方法参考。

    关键词:根际细菌,上清液,青枯菌,铁载体

    材料与试剂

    1.胰蛋白胨 (OXOID, TRYPTONE, catalog number: LP0042)

    2.大豆蛋白胨 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalog number: 69047737) 

    3.氯化钠 (南京化学试剂有限公司)

    4.磷酸氢二钾 (南京化学试剂有限公司)

    5.七水合硫酸镁 (南京化学试剂有限公司)

    6.丙三醇 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalog number: 10010618)

    7.酪蛋白氨基酸 (DSLAB, catalog number: 18A0050)

    8.氯化铁 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalog number: 10011918)

    9.TTC (2,3,5-三苯基氯化四氮唑) (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 30187713)

    10.葡萄糖 (南京化学试剂有限公司)

    11.酵母粉 (OXOID, YEAST EXTRACT, LP0021)

    12.牛肉膏 (国药集团化学试剂有限公司,沃凯,catalog number: 69004461)

    13.琼脂 (福建省金燕海洋生物科技股份,乘风)

    14.青枯菌 (QL-Rs1115) (Wei et al., 2011)

    15.TSB培养基 (见溶液配方)

    16.TSA固体培养基 (见溶液配方)

    17.MKB限铁培养基 (见溶液配方)

    18.MKB富铁培养基 (见溶液配方)

    19.NA培养基 (见溶液配方)

    20.TTC培养基 (见溶液配方)

    仪器设备

    1.96道手动移液工作站 (苏州中析仪器有限公司,中析,catalog number: SC9000)

    2.酶标板离心机 (湖南赫西仪器,台式低速离心机,TD5A)

    3.恒温摇床 (MIN QUAN, MQD-BIR)

    4.酶标仪 (SpectraMax M5, Sunnyvale, CA, USA)

    5.96孔板 (96 well costar clear)

    6.-80 °C冰箱 (海尔,立式超低温保存箱,DW-86L626, 2013款)

    7.高压灭菌锅 (日本,鸟取,Tega SANYO Industry Co., Ltd, mlS-3780)

    8.天平 (sartorius BSA2202S)

    9.移液枪 (Eppendorf Research plus)

    10.涡旋仪 (SCIENTIFIC INDUSTRIES, USA)

    11.96孔板0.22 μm滤膜 (Millipore®, MultiScreenHTS GV Filter Plate, 0.22 µm, clear, sterile, MSGVS2210)

    软件和数据库

    1.Excel 2016

    2.R语言 (R 3.1.2)

    3.SPSS 20

    4.Adobe Illustrator CS5

    实验步骤

    1.根际细菌菌株的活化

    将菌种活化,从-80 °C冰箱中取出保存的甘油菌种,利用手动移液工作站转移5 μl甘油菌种至一个新的96孔板,每孔含有195 μl TSB培养基,于170 rpm 30 °C摇床中培养过夜。

    2.病原青枯菌的活化

    从-80 °C取出甘油管保存菌株,于含有TTC的NA培养基上划线,30 °C培养48 h。挑取单菌于NA液体培养基中30 °C,170 rpm摇床里培养12 h制备青枯菌菌悬液,调至OD600 = 0.5。

    3.富铁、限铁、补铁上清液的收集制备

    转移10 μl培养过夜的根际细菌的菌悬液加入到分别含有190 μl MKB限铁培养基和MKB富铁培养基的96孔板中。将限铁和富铁培养基中的根际分离细菌于170 rpm 30 °C的摇床中培养48 h。将这些菌悬液用酶标板离心机离心,900 x g,离心5 min。将上清液用96孔板滤膜 (0.22 μm) 过滤得到无菌发酵液。

    3.1从富铁条件下收集的上清液 (在MKB富铁培养基中生长的根际细菌,发酵液中仅含少量铁载体或者不含铁载体,主要是分泌产生的其他化合物SNri) 。

    3.2从限铁条件下收集的上清液 (在MKB限铁培养基中生长的根际细菌,因缺铁触发铁载体的产生,因此发酵液中含有大量铁载体和分泌产生的其他化合物SNli) 。

    3.3先收集在限铁条件下根际细菌的上清液,紧接着向上清液中添加50 μmol L-1 FeCl3,触发铁载体和铁的螯合反应 (SNre) 。

    3.4作为对照,我们使用无菌水代替上清液 (SNcontrol) 。

    4.根际细菌不同处理下获得的上清液对病原青枯菌生长的影响

    将限铁条件获得的上清液 (i; SNli) 加入到限铁培养基中培养青枯菌;将富铁条件下获得的上清液 (ii; SNri) 加入到富铁的培养基中培养青枯菌;将补足铁的限铁上清液 (iii; SNre) 添加到富铁培养基中培养青枯菌。(图1)

    图1. 评估根际细菌产生的铁载体对青枯菌生长影响的试验设计图

    所有测量均在装有180 μl 10% MKB培养基的微孔板上进行,该培养基接种了2 μl青枯菌菌悬液和20 μl前面试验获得的无菌上清液。然后将青枯菌和上清液在30 °C振荡 (旋转摇床设定为170 rpm) 下培养,并在培养24 h后利用酶标仪,以光密度测量青枯菌的生物量 (OD600) 。用与对照处理相比的相对影响来计算每个根际细菌无菌上清液对青枯菌生长的影响,计算公式为:GEtreatment =((SNtreatment / SNcontrol) -1) * 100,其中SNtreatment = SNli,SNri或SNre。小于和大于零的值分别表示根际细菌上清液对青枯菌具有生长抑制和促进作用,表示为倍数变化百分数。通过从限铁条件下上清液对青枯菌生长的作用中减去补足铁的限铁上清液对青枯菌生长的作用,得到根际细菌分泌的铁载体对青枯菌生长的作用。为了明确这个方法评估铁载体介导作用的有效性,本研究中又用相同的方法测定了两种已知的铁载体生产菌株 (P . aeruginosa PAO1 和 B. cepacia H111) 及其相应的铁载体缺陷型突变体 (P . aeruginosa PAO1pvdDpchEF 和 B. cepacia H111orbJpchAB) (Ghysels et al., 2005, Sathe et al., 2019) 在限铁和补铁条件下对青枯菌生长的影响,铁载体介导的野生型菌株(P . aeruginosa PAO1 和 B. cepacia H111)对病原青枯菌的作用分别是较强和较轻的抑制作用,而这两个菌株对应的铁载体缺陷型突变体因为不产铁载体所以测出铁载体介导的作用接近0(图2)。最后用相同的评估方法去评估这四株已知菌株铁载体介导的对青枯菌生长的影响。(图3)

    图2. 铁载体介导的已知菌株对青枯菌生长的影响

    图3. 铁载体介导的根际细菌对病原青枯菌生长影响试验流程示意图

    结果与分析

    将2,150株根际细菌分别置于富铁条件下培养得到的无菌上清液 (代谢物质中仅含有少量铁载体或者无铁载体) 加入富铁培养基中培养青枯菌,研究富铁条件下根际细菌分泌的非铁载体代谢产物对青枯菌生长的影响。结果显示,这些根际细菌上清液对青枯菌生长的作用较温和,绝大多数根际细菌对青枯菌生长的抑制和促进率都低于50%,并且主要以促进作用为主 (图4. A) 。而将2,150株根际细菌分别接种在限铁培养基培养得到的无菌上清液 (代谢物质中含有大量的铁载体) 加入限铁培养基中培养青枯菌的结果显示,这些上清液对青枯菌的生长具有更为强烈的影响,既有强烈的抑制作用又有强烈的促进作用,促进和抑制菌株的作用程度分布在-100%到200%区间 (图4. A) 。

    图4. 根际细菌铁载体对青枯菌生长的影响. 图A描绘的是在限铁处理 (富含铁载体和其他代谢产物的作用,黄色) ,富铁处理 (不含或者仅含少量铁载体,主要是其他代谢产物的作用,紫色) 和限铁上清液补充足量铁的补铁处理 (去除了铁载体作用,同时保留了其他代谢物的作用,蓝色) ,通过从限铁处理的上清液作用 (黄色) 中减去补铁处理的上清液作用 (蓝色) 评估出仅由铁载体引起的作用。对应的作用增长值用百分比表示。图B描绘根际细菌在限铁条件下所有代谢产物和铁载体介导的对青枯菌生长效应的相关性分析。

    为了分析限铁条件下除铁载体以外的其他代谢产物介导的根际细菌对青枯菌生长的作用,进一步将2,150株根际细菌在限铁条件下得到的上清液补足铁,并加入富铁培养基培养青枯菌,此时由于铁充足,铁载体无法发挥作用,因此主要是其他代谢产物介导的作用。研究发现,限铁条件下其他代谢产物介导的根际细菌对青枯菌生长的作用和富铁条件下上清液介导根际细菌对青枯菌生长的作用无显著差异 (图4. A) ,说明限铁和富铁条件下根际细菌其他代谢产物介导的作用无显著变化。

    将限铁条件下根际细菌上清液中总代谢物质和铁载体介导的对青枯菌的作用进行相关性分析,结果显示,铁载体解释了限铁条件下上清液中总代谢物质介导作用的76% (图4. B) 。综合以上结果可以表明,铁载体是根际细菌与青枯菌的互作中重要的影响因子。

    失败经验

    1.MKB培养基配置过程中所有用品,包括盛放的玻璃瓶、量筒、玻璃棒以及称量勺等都需保证无铁操作,其中玻璃瓶、量瓶等容器需用盐酸浸泡过夜,以去除瓶中原有的铁,使用时用大量纯水洗至容器中无残留的盐酸,避免盐酸的残留影响实验结果。

    2.MKB培养基需分开配制与灭菌,用时混合。

    溶液配方

    1.TSB培养基

    胰蛋白胨15 g L-1,大豆蛋白胨5 g L-1,氯化钠5 g L-1, pH7.2, 115 °C灭菌30 min

    2.TSA固体培养基

    TSB培养基加15 g L-1琼脂条

    3.MKB限铁培养基

    3.1首先分别配制以下四种溶液

    1)酪蛋白氨基酸50 g,甘油 (丙三醇) 15 ml加去离子水定容至1 L

    2)磷酸氢二钾2.5 g溶于100 ml去离子水中

    3)七水合硫酸镁2.5 g溶于100 ml去离子水中

    3.2分开配制完成后,分别独立灭菌,115 °C灭菌30 min,pH 7.2,用时将1) 2) 3) 混合

    4.MKB富铁培养基

    MKB限铁培养基中加50 μmol L-1 氯化铁

    5.NA培养基

    葡萄糖10 g L-1,蛋白胨5 g L-1,酵母粉0.5 g L-1,牛肉膏3 g L-1

    6.TTC培养基

    NA培养基中加TTC至终浓度为0.05g L-1

    致谢

    本研究由国家自然科学基金 (41922053, 41807045, 31972504) ,江苏省自然科学基金(BK20180527, BK20170085) 资助,依托于南京农业大学资源与环境科学学院微生态与根际健康实验室 (LorMe) 顺利完成这项实验。该实验方案摘自顾少华毕业论文及发表的文章 (Gu et al., 2020) 。

    参考文献

    1.Ghysels, B., U. Ochsner, U. Mollman, L. Heinisch, M. Vasil, P. Cornelis and S. Matthijs (2005) . The Pseudomonas aeruginosa pirA gene encodes a second receptor for ferrienterobactin and synthetic catecholate analogues. FEMS Microbiol Lett 246(2): 167-174.3.

    2.Gu, S., Z. Wei, Z. Shao, V. P. Friman, K. Cao, T. Yang, J. Kramer, X. Wang, M. Li, X. Mei, Y. Xu, Q. Shen, R. Kummerli and A. Jousset (2020) . Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizosphere microbiomes. Nat Microbiol 5(8): 1002-1010.1.

    3.Sathe, S., A. Mathew, K. Agnoli, L. Eberl and R. Kummerli (2019) . Genetic architecture constrains exploitation of siderophore cooperation in the bacterium Burkholderia cenocepacia. Evol Lett 3(6): 610-622.4.

    4.Wei, Z., X. M. Yang, S. X. Yin, Q. R. Shen, W. Ran and Y. C. Xu (2011) . Efficacy of Bacillus-fortified organic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field. Applied Soil Ecology 48(2): 152-159.2.

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  • 视频:南京农大教授韦中介绍论文内容在作物根际土壤中,存在着复杂而多样的微生物。当病原菌入侵时,一场肉眼看不见的资源争夺战开始了。其中,是根际微生物和土传病原菌争夺的核心稀缺资源之一。南...

    视频:南京农大教授韦中介绍论文内容

    在作物根际土壤中,存在着复杂而多样的微生物。当病原菌入侵时,一场肉眼看不见的资源争夺战开始了。

    其中,铁是根际微生物和土传病原菌争夺的核心稀缺资源之一。

    南京农业大学资源与环境科学学院教授沈其荣团队联合瑞士、荷兰、英国学者发现,根际微生物铁载体介导根际菌群与土传病原青枯菌的相互作用,决定着作物健康。

    北京时间2020年5月11日晚23时,《自然—微生物学》在线发表了这一成果。

     

    核心稀缺资源“铁”

    “由土传病原菌引起的作物土传病害已经成为制约全球粮食优质高产和农业可持续发展的重要因素。”沈其荣告诉《中国科学报》,从根际土壤微生物的角度出发,在土传病原菌没接触根系之前将其遏制,是非常重要的。“这是土壤肥料工作者解决土传病害问题的切入点。”

    土传青枯病是生产上的痛点。

    论文共同通讯作者、南京农业大学教授徐阳春介绍,由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的土传青枯病是全世界最严重的细菌性病害之一,在我国尤为严重。

    青枯菌在土壤中的存活时间长,能够侵染番茄、辣椒、烟草、花生等重要经济作物,常导致作物减产,甚至绝收。

    论文作者、瑞士苏黎世大学教授Rolf Kümmerli告诉《中国科学报》,越来越多的证据表明,土壤微生物组对植物的生长和健康具有重要的影响。但是,尚不清楚哪些细菌性状驱动这种作用。

    论文共同通讯作者、南京农业大学教授韦中在接受《中国科学报》采访时提到了土传青枯病研究中一直存在的几个疑问:入侵过程中病原菌种群数量急剧增加,是否存在一些土壤微生物为病原菌的入侵提供稀缺的关键营养资源?如果根际微生物能提前占据这些核心稀缺营养,会不会有效抑制病原菌的入侵?

    “铁符合稀缺和核心资源的条件。”韦中说。

    作为细胞代谢不可或缺的元素,铁在环境中的生物有效性很低、有效形态单一(仅三价铁Fe3+)。植物根系和根际微生物对三价铁的竞争利用非常激烈。

     

    该团队在沈其荣(右六)带领下建立了良好的国内和国际合作。后排左二为徐阳春,右四为韦中。(南京农大供图)

     

    “青枯菌的入侵,以及种群数量的激增是有寄主优势的。”韦中说,病原菌种群数量激增必然需要大量资源,碳、氮等资源可以由土壤—植物系统提供,但稀缺的必须元素铁只能靠争夺获得。“只有产生铁载体的能力强,并且它的铁载体又不能被病原菌利用,这样的根际菌群才能更好的利用碳、氮等其他资源,保持较高的种群数量。”

    其中发挥重要作用的铁载体,是由细菌分泌的结构多样性的化合物,主要用来螯合环境中稀缺的三价铁。

    Kümmerli解释道,细菌需要特定的受体才能吸收对应结构的铁—铁载体螯合物。

    “铁载体可能被病原菌识别和‘窃取’,促进病原菌的生长;也可能不被病原菌识别,而是作为根际细菌的私有物品,进而抑制病原菌。”论文第一作者、博士生顾少华说。

    尽管关于铁载体的研究很多,但在几年前,几乎没有人从群落层面上研究铁载体的作用。

    直到2015年,韦中在一次国际会议上了解到,Kümmerli等人从土壤和湖水中分离出几百株假单胞菌,研究其产生的铁载体。

    “非常有意思,当时这项工作的成果还没有发表。根际微生物种类非常复杂,我们不能仅仅聚焦在假单胞菌,应选择更多类群才能有代表性,并且用几千种细菌做研究,这样在未来几年发表时才可能有竞争力。”韦中说,他们的合作也从那时开始。

    抑制型VS.便利型

    他们从土壤中分离出2000多种根际细菌,并分别加入铁缺乏的发酵液中分析其变化。

    结果发现,95%的根际细菌都能产生铁载体,并且铁载体的产生能提高自身的生长能力。

    一般认为,铁载体分泌是细菌适应缺铁环境的普遍机制,但缺少有力的证据。论文审稿人评论道:“这项成果是支撑该假说最好的大规模实证研究。”

    随后研究发现,有些铁载体可以抑制青枯菌生长,产量越大抑制能力越强,被称为抑制型;而一些低产细菌产生的铁载体却为青枯菌的生长提供了便利,被称为便利型铁载体。

    韦中说,合理的解释是,当便利型铁载体介导促进效应时,根际细菌的铁素竞争力弱,分泌的铁载体被青枯菌剥削利用,促进了青枯菌的生长,而自身由于分泌铁载体消耗了大量的能量,却无法回收自己的铁载体获得铁素营养,因此生长受阻;反之亦然。

    为了验证铁载体作用的重要程度,他们给这些铁缺乏的发酵液中补充铁元素,并用来培养青枯菌。

    结果证实,限铁条件下,铁载体发挥的作用占细菌总代谢物质发挥效应的76%。

    “这充分诠释了铁载体是主导根际微生物—青枯菌互作的重要驱动力。”韦中说。

    “以往我们认为,抑菌物质是根际有益微生物发挥抑制病原菌功能的重要因素。从这一结果来看,稀缺资源的竞争,特别是铁载体介导的铁营养竞争,可能在根际菌群互作中发挥着更为重要的作用。”沈其荣说。

    顾少华告诉记者,有意思的是,大肠杆菌属和金黄杆菌属总体产生铁载体的能力特别强,对青枯菌有很强的抑制能力;而芽孢杆菌属总体产铁载体能力弱,对青枯菌生长总体有促进作用。

    “这跟之前的常识有些不太一样。人们往往认为芽孢杆菌是有益微生物,能抑制病原菌。”顾少华认为,这一结果恰恰说明微生物的世界很复杂。

    韦中介绍,进一步研究根际细菌与青枯菌的系统发育距离发现,抑制作用最强的细菌是,与青枯菌系统发育距离相对较近并产生大量铁载体的分离株。

    这与生态学理论相一致,密切相关的物种之间因为生态位重叠的可能性更高,因此资源竞争更剧烈。

     

    根际分离细菌分类地位与铁载体产生及作用之间的关系(南京农大供图)。右上为18个丰度较高属的根际分离细菌铁载体产生和作用情况,右下为根际分离细菌与青枯菌之间的系统发育距离、铁载体的产生及作用之间关系的综合分析。

      

    “秘密武器”铁载体

    在真实而复杂的土壤环境中,上述结论是否仍然适用呢?

    “把室内理论发现与田间实际现象结合起来,这是科学技术向生产力转化的关键一步,因为我们必须要解决实际生产中的问题。”徐阳春说。

    “这项研究的新颖之处在于,它将常规微生物组分析与体外试验、植物试验方法相结合,从而确定了土壤微生物组的组成、关键功能性状和植物健康之间的因果关系。”Kümmerli说。

    2018年,经过360种根际细菌、几千棵番茄的田间试验后,他们终于回答了上述问题:产生抑制型铁载体的根际细菌与青枯菌的共存能力较强,而产生便利型铁载体的根际细菌与青枯菌的共存能力较弱。

     

    铁载体介导根际菌群与病原菌的铁素竞争与便利关系(南京农大供图)

      

    这些强共存竞争能力的微生物能否保护植物的健康呢?“这是我们最终需要回答的问题,也是找到对付土传青枯病的措施的关键所在。”韦中说。

    “我们证明了铁载体介导的根际细菌与青枯菌之间的铁竞争,是预测土壤微生物群落中细菌—青枯菌共存模式、决定病原菌是否入侵成功,以及对宿主植物造成破坏的普遍机制。”Kümmerli说,利用上述研究结论,可以工程化生产抑制型铁载体微生物。

    徐阳春告诉《中国科学报》,该研究说明,铁载体为利用根际有益菌解决土传青枯病问题、开拓植物健康的“靶向疗法”提供了新思路。“也就是说,在育苗阶段加入高产且铁载体不会被病原菌‘窃取’的有益微生物,可以有效保护植物健康。”

    “我们的研究是基于大规模的表型和竞争分析得到的。未来,仍需要分子水平的直接证明,才能将发现的原理更好的转化为现实应用。”韦中说。

     

    相关论文信息:

    https://doi.org/10.1038/s41564-020-0719-8

     

    编辑 | 余   荷

    排版 | 王大雪

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空空如也

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铁载体