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  • matlab开发-偏最小二乘法判别分析法。使用PLS进行判别分析的教程和工具。
  • Matlab偏最小二乘法用于判,,,别分析
  • 生信学习-代谢组检测 分析之 PLS-DA

    千次阅读 2021-01-06 10:51:45
    偏最小二乘法判别分析是一种用于判别分析的多变量统计分析方法。 判别分析是一种根据观察或测量到的若干变量值,来判断研究对象如何分类的常用统计分析方法。 其原理是对不同处理样本(如观测样本、对照样本)的...

    代谢组检测 分析之 PLS-DA

    偏最小二乘判别分析(Partial least squares Discriminant Analysis, PLS-DA)

    偏最小二乘法判别分析是一种用于判别分析的多变量统计分析方法。

    判别分析是一种根据观察或测量到的若干变量值,来判断研究对象如何分类的常用统计分析方法。

    其原理是对不同处理样本(如观测样本、对照样本)的特性分别进行训练,产生训练集,并检验训练集的可信度。

    PLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法。可以PLS-DA建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型,来实现对样品类别的预测。

    可以通过计算变量投影重要度( Variable Importance for the Projection, VIP)来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力, 从而辅助标志代谢物的筛选(通常以 VIP值 > 1.0 作为筛选标准)

    偏最小二乘法判别分析pls-da所需数据:

    分组信息;因变量和自变量;样本与变量之间的数据矩阵

    参考图片

    b PLS-DA plot comparison of metabolite profiles of mice based on disease activity of their original human donors (active pre-and post-HSCT) and (inactive post-HSCT).

    (Integrated microbiota and metabolite profiles link Crohn's disease to sulfur metabolism.)

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  • 方法 采用全-精细指纹图谱和多指标含量同时测定对栀子炒制前后样品进行分析,采用层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析对栀子与炒栀子指纹图谱进行比较,筛选出...

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     要:目的  比较栀子炒制前后化学成分差异,明确其差异标志物,为栀子与炒栀子质量标准的制定提供参考。方法  采用全-精细指纹图谱和多指标含量同时测定对栀子炒制前后样品进行分析,采用层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析对栀子与炒栀子指纹图谱进行比较,筛选出导致差异的特征性成分。结果  栀子炒制前后指纹图谱中共有15个峰,其中12个峰为两者所共有,栀子与炒栀子对照指纹图谱的全指纹图谱相似度为0.991,而去除栀子苷积分后建立的精细指纹图谱相似度为0.880,低于0.90,可基本实现两者区分;多元统计分析结果表明栀子与炒栀子可明显分为2类,并筛选得到贡献度较大的4个差异标志物,分别为峰359(栀子苷)、11(西红花苷I);含量测定结果表明栀子炒制后栀子苷、西红花苷I、西红花苷II含量显著降低,而去乙酰车叶草酸甲酯含量显著升高。结论 栀子炒制前后成分差异显著,建立的精细指纹图谱结合多成分含量测定方法可有效区分栀子与炒栀子,筛选得到的差异标志物可为其质量标志物的选择提供参考。

    栀子始载于《神农本草经》,为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实[1],现收载于《中国药典》2015年版,具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒功效[2],炒栀子为栀子照清炒法炒至黄褐色所得炮制品,炒制后可缓解其寒性,减少对肠胃的刺激[3-5]。随着中药现代化、国际化进程的加快,中药质量标准不断完善,中药“饮片炮制前后的成分变化”“生熟异治中药饮片有别于中药材的专属性鉴别指标研究”等已列入《中国药典》2020年版重点开展的工作[6]。《中国药典》2015年版栀子项下针对栀子和炒栀子均只对栀子苷含量进行限定,仅靠栀子苷单一指标不能全面反映栀子与炒栀子饮片的质量,因此对栀子炒制前后化学成分差异进行系统研究,明确其差异标志物,对栀子及其炮制品质量标准的提升非常有必要。

    指纹图谱可以较为全面地反映中药所含化学成分,已成为中药质量全面控制的一种重要手段;指纹图谱结合多元统计分析可用于不同产地、基原、炮制品的差异评价,筛选得到其差异标志物[7-15]。因此为明确栀子炒制前后化学成分变化及其差异标志物,本实验采用课题组前期建立的栀子指纹图谱和多指标成分含量测定方法[9],对栀子与炒栀子全/精细指纹图谱及去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I和西红花苷II 5种指标成分含量进行分析,进而结合聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)多元统计分析方法对栀子及炒栀子化学成分差异进行全面评价,明确其差异标志物,为栀子和炒栀子质量标准的建立及质量标志物的选择提供参考。

    1  仪器与材料

    Agilent 1260高效液相色谱仪,四元泵,自动进样器,柱温箱,DAD检测器,Agilent Chemstation(C.01.03)色谱工作站,美国安捷伦科技有限公司;KH-500E型超声波清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司;FA2104电子分析天平,上海良平仪器仪表公司;MT-5精密天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;Milli-Q超纯水制备仪,SynergyTM超纯水系统,美国Millipore公司;高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司。

    对照品栀子苷(批号110749-201718,质量分数≥97.6%)、西红花苷I(批号111588-201303,质量分数≥92.6%)、西红花苷II(批号111589-201705,质量分数≥92.2%)、去乙酰车叶草酸甲酯(批号111788-201602,质量分数≥94.3%),均购自中国食品药品检定研究院;对照品京尼平龙胆双糖苷(批号LW16021804,质量分数≥98%)购自南京良纬生物科技有限公司;以上对照品均为含量测定用。乙腈,HPLC纯,Tedia公司;水为实验室自制超纯水;其余试剂均为分析纯。

    10批栀子采集于江西抚州,经南京中医药大学邹立思实验员鉴定为茜草科栀子属植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实,样品批号分别为170501170518170603170611170621170709170721180610180629180613,编号S1S10

    2  方法与结果

    2.1  炒栀子的制备

    10批(S1S10)净栀子,照清炒法(《中国药典》2015年版通则0213)炒至黄褐色,即得炒栀子,编号CS1CS10

    2.2  栀子与炒栀子饮片HPLC-精细指纹图谱的建立

    2.2.1  指纹图谱方法  参照本课题组前期建立的栀子药材指纹图谱分析方法[9],并以CS1作为供试品溶液进行方法学考察,以9号峰(栀子苷)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。精密度、稳定性、重复性结果均表明各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%,表明建立的方法同样适用于江西抚州栀子与炒栀子指纹图谱的分析。

    2.2.2 栀子与炒栀子共有峰的标定  10批栀子与炒栀子样品,进行指纹图谱分析,得10批栀子与炒栀子样品HPLC色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)进行色谱峰匹配,样品S1CS1图谱分别作为参照图谱,选择中位数法生成对照图谱,采用多点校正法建立指纹图谱,得到栀子与炒栀子全指纹图谱,见图1-AB,全指纹图谱的对照指纹图谱见图2-AB,以峰面积大于总峰面积0.5%的色谱峰作为共有峰,栀子共标定了12个共有峰,炒栀子共标定了15个共有峰,共有峰的总面积均占样品总峰面积的90%以上,峰36、10在炒栀子中含量较高,标定为共有峰,而栀子中此3个峰峰面积较小,未被标定为共有峰。栀子炒制前后,除8号色谱峰峰面积变化无显著性差异(P0.05),其他14个共有峰炒制前、后变化显著(P0.01),栀子炒制后峰125791115峰面积降低,峰34610峰面积升高。样品共有峰中4891112号峰得到了化学指认,依次为乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II

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    2.3  指纹图谱相似度评价

    2.3.1 全指纹图谱相似度  根据全指纹图谱计算每批样品指纹图谱相似度,每批栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.9970.9991.0001.0000.9980.9991.0001.0000.9990.999,炒栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.9990.9990.9990.9980.9990.9990.9991.0001.0000.999,表明不同批次栀子与炒栀子质量一致性较好;每批栀子与炒栀子对照指纹图谱相似度分别为0.9790.9950.9890.9920.9860.9910.9910.9920.9850.985,每批炒栀子与栀子对照指纹图谱相似度分别为0.9910.9890.9900.9850.9950.9890.9950.9900.9890.995,同批次栀子与炒栀子相似度分别为0.9810.9930.9890.9860.9910.9900.9960.9910.9830.991,且栀子对照指纹图谱与炒栀子对照指纹图谱相似度为0.991,相似度均高于0.98,而一般相似度高于0.90,即被认定为同种样品,因此根据全指纹图谱相似度结果完全无法区分栀子与炒栀子。

    2.3.2 精细指纹图谱相似度  由于栀子苷峰面积远高于其他色谱峰,在进行相似度计算时,其权重较大,掩盖了其他色谱峰的贡献,不能反映栀子炒制前后细微变化,因此将各批次样品中栀子苷不进行积分,得到栀子与炒栀子精细对照指纹图谱(图3-AB),并再次进行相似度评价,结果每批栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.9910.9790.9970.9980.9580.9150.9980.9910.9960.992,炒栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.9700.9580.9690.9630.9700.9720.9660.9860.9840.981,相似度均高于0.90;而每批栀子与炒栀子对照指纹图谱相似度分别为0.8450.9140.8790.8800.8290.7970.8760.8880.8600.861,每批炒栀子与栀子对照指纹图谱相似度分别为0.8200.7650.7910.9080.9510.8420.9590.8410.8100.910,同批次栀子与炒栀子相似度分别为0.7900.8160.7880.8990.9020.7800.9560.8470.7840.891;且栀子对照指纹图谱与炒栀子对照指纹图谱相似度为0.880,相似度均显著降低,因此精细指纹图谱与全指纹图谱相比基本可以实现栀子与炒栀子的区分,且能更好地反映样品批次间差异。

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    2.4  栀子与炒栀子指纹图谱多元统计分析

    2.4.1 HCA  将栀子与炒栀子共有峰的峰面积数据输入悟空平台(https://www.omicsolution.org/wkomics/main),进行层次聚类分析(HCA),数据进行标准化处理,结果见图4,由图可见栀子与炒栀子样品可明显聚为2类,其组成差异通过热图直观体现,栀子中色谱峰125791115峰面积明显高于炒栀子,而34610号色谱峰在炒栀子中峰面积相对较高。

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    2.4.2 PCA  10批栀子与炒栀子中共有峰的峰面积数据导入SIMCA-P(version 13.0.3)软件中,进行PCA,从15个共有峰中提取出2个贡献率较大的主成分,解释了原始数据的87.66%,以此2个新变量对样品进行分析,得到样品PCA得分图,结果见图5-A,由图可见栀子与炒栀子明显分为2类。

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    2.4.3 OPLS-DA  对栀子与炒栀子指纹图谱数据进行有监督OPLS-DA。建立OPLS-DA模型,该模型解释和预测能力较好(R2X0.985R2Y0.995Q20.99),且稳定可靠(CV-ANOVAP5.49×10−11)。通过图5-B OPLS-DA得分图发现,栀子与炒栀子明显分布在2个象限,表明其化学成分具有显著的差异。进一步以VIP值>1作为筛选标准,筛选出栀子与炒栀子主要差异色谱峰,见图5-C9(栀子苷)、11(西红花苷I)、53号峰为其差异主要指标性成分,栀子中5911号峰峰面积高于炒栀子,而3号峰则低于炒栀子。

    2.5  栀子炒制前后5种成分含量变化

    2.5.1  含量测定方法  参照本课题前期建立的栀子药材5种指标成分含量测定方法[9],并以CS1作为供试品溶液进行方法学考察,结果表明回归方程、线性范围及相关系数分别为去乙酰车叶草酸甲酯Y13.241 X2.23843.1131.12 μg/mLr20.999 9;京尼平龙胆双糖苷Y8.7039 X1.214 70.8988.5 μg/mLr20.999 8;栀子苷Y14.256  X14.8544.94493.86 μg/mLr20.999 8;西红花苷I Y56.85 X0.113 70.1110.93 μg/mLr20.999 8;西红花苷IIY62.668 X0.520 80.201.97 μg/mLr21.000 0;去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II峰面积的平均回收率分别为102.52%101.84%97.26%102.53%103.70%RSD值分别为1.02%0.35%0.63%0.88%2.26%,均符合《中国药典》2015年版规定,表明建立的方法同样适用于江西抚州栀子与炒栀子5种指标成分的含量测定。栀子与炒栀子色谱图见图6

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    2.5.2 样品含量测定  10批栀子与炒栀子药材进行测定,计算各成分含量,结果见表1。栀子中去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II平均质量分数分别为0.968.7166.063.050.43 mg/g,炒栀子中此5种成分平均质量分数分别为1.868.6051.961.350.18 mg/g。采用SPSS 21.0统计学软件,对栀子炒制前后5种成分的质量分数进行配对样本t检验,结果表明炒制后栀子苷、西红花苷I、西红花苷II质量分数显著降低(P0.01),平均质量分数分别降低21.34%55.74%58.14%;去乙酰车叶草酸甲酯质量分数显著升高(P0.01),平均质量分数升高93.75%,而京尼平龙胆双糖苷质量分数变化无统计学差异(P0.05)。

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    3  讨论

    栀子为临床常用中药,其炮制品包括炒栀子、焦栀子、栀子炭、姜栀子等,现有文献多采用指纹图谱结合多元统计分析对栀子及其不同炮制品进行区分,文献报道栀子与其不同炮制品相似度均高于0.90,不能有效区分栀子与其炮制品[16-18],且多元统计分析需要大量数据做支撑,该方法不适宜于生产实践中采用。前期研究发现栀子苷在栀子指纹图谱中所占权重较大,全指纹图谱完全无法实现栀子与炒栀子的区分,而去除栀子苷积分后,栀子与炒栀子相似度显著降低,因此本实验中建立栀子炒制前后全/精细指纹图谱,精细指纹图谱相似度结果表明栀子与炒栀子相似度与全指纹图谱相似度相比显著降低,可基本实现两者区分;进一步采用多元统计分析及含量测定方法筛选得到栀子与炒栀子差异性指标成分,结果表明除栀子苷外,西红花苷I、去乙酰车叶草酸甲酯等成分为栀子与炒栀子的主要差异性成分。

    本实验对栀子及其炮制品炒栀子进行了系统的分析,建立的精细指纹图谱的对照图谱可作为后续栀子与炒栀子样品区分及质量一致性评价的参照,且通过精细指纹图谱与多元统计分析相结合的方法,筛选得到栀子与炒栀子的主要差异性标志物,可为栀子与炒栀子质量标准的提升提供参考。但由于本研究仅收集了同一产地的10批栀子样品,因此覆盖度不够广,今后应收集不同产地炒制前后栀子样品,以使建立的精细指纹图谱更有代表性,且进一步结合液质联用技术,更全面地评价栀子炒制过程中化学成分变化。此外,中药质量标准提升的根本目的是保证其临床疗效,目前,基于化学基准的中药质量控制模式存在以偏概全、难关药效的局限,因此仍需围绕质量标志物建立的原则[19],广泛深入开展栀子与炒栀子体内代谢、药理药效差异等研究,以制定出科学合理和顺应临床应用的栀子饮片及其炮制品的质量标准。

    参考文献(略) 

    来  源:   黄萌萌,王  琪,李晓琦,陈  彦. 基于全-精细指纹图谱与多元统计分析的栀子炒制前后差异评价 [J]. 中草药, 2020, 51(9): 2460-2466.

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  • 摘要:目的 采用UPLC法建立...方法 基于UPLC法建立3种不同年份共47批吴茱萸样品的指纹图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)计算相似度,运用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-...

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     要:目的  采用UPLC法建立不同年份吴茱萸指纹图谱,结合化学模式识别技术对其进行分析,并测定其中4种质量差异性标志物的含量,为吴茱萸“陈久者良”的研究提供新的思路和对其质量评价提供依据。方法  基于UPLC法建立3种不同年份共47批吴茱萸样品的指纹图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)计算相似度,运用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对样品进行模式识别。结果 建立了47批吴茱萸样品的UPLC指纹图谱(相似度均>0.997),标定了40个共有峰,指认了其中12个,运用PCAOPLS-DA分析,有效区分了3种不同年份的吴茱萸,共筛选出22个质量差异性标志物,并对其中新绿原酸、绿原酸、吴茱萸碱和吴茱萸次碱4种成分的含量进行了测定。结论 通过吴茱萸UPLC指纹图谱与多成分化学模式识别技术相结合,能对不同年份的吴茱萸进行有效区分,为吴茱萸“陈久者良”及其质量控制提供参考依据。

    吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎E. rutaecarpa(Juss.) Benth. var. officinalis (Dode)Huang或疏毛吴茱萸E. rutaecarpa (Juss.) Benth.var. bodinieri (Dode) Huang 的干燥近熟果实。其性味辛、苦,热;有小毒,具有温中散寒、降逆止呕、助阳止泻之功[1]。化学成分包括生物碱、柠檬苦素、黄酮、酚酸、多糖和挥发油等类[2-9]

    吴茱萸为中药“六陈”之一,首载于梁陶弘景的《本草经集注》:“凡狼毒、枳实、橘皮、半夏、麻黄、吴茱萸皆欲得陈久者,其余唯须新精。[10]”张从正《儒门事亲》中亦有“药有六陈,陈久为良,狼茱半橘,枳实麻黄”[11]之言。新鲜的吴茱萸气味重,刺激性较强,通过陈放可使其药气逐渐挥发,化学成分缓慢变化[12],药性趋于缓和,避免服用时可能产生的毒副作用。张慧芳等[13]发现不同储藏时间和条件对吴茱萸挥发性成分的影响较大,但受限于药材批次(3批),无法准确表述不同年份吴茱萸之间的差异性。本实验采用UPLC指纹图谱结合化学模式识别的方式,通过相似度评价、SIMCA 14.1模式识别统计分析软件中主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),区别于以往对产地或基原关系的化学模式判别[14-15],对47批吴茱萸样品中40个共有峰的差异性标志物进行筛选,揭示3种不同年份吴茱萸的差异,为“陈久者良”提供新的研究思路及其质量控制提供参考依据。

    1  仪器与试剂

    Waters UPLC ACQUITYH-Class型超高效液相色谱仪,包括四元溶剂管理器、SM-FTN样品管理器、柱温箱、二极管阵列(PDA)检测器和Empower 3色谱工作站(美国waters公司);AE240十万分之一电子天平(美国Mettle公司);SQP型电子天平 [万分之一,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]YB502N电子天平(百分之一,上海海康电子仪器厂);KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,功率200 W,频率40 KHz);Milli QB型超纯水净化系统(美国Millipore公司)。

    吴茱萸碱(批号110802-201710,质量分数≥99.6%)、吴茱萸次碱(批号110801-201608,质量分数≥99.7%),去氢吴茱萸碱(批号20531-201703,质量分数≥98%)购于中国食品药品检定研究院;异鼠李素-3-O-芸香糖苷(批号CHB170224,质量分数≥98%)、吴茱萸卡品碱(批号CHB170224,质量分数≥98%)、二氢吴茱萸卡品碱(批号CHB180316,质量分数≥98%)购于成都克洛玛生物科技有限公司;绿原酸(批号D19-150210,质量分数≥98%)、新绿原酸(批号BCTG-0231,质量分数≥98%)、隐绿原酸(批号BCTG-0210,质量分数≥98%)、咖啡酸(批号BCTG-0286,质量分数≥98%)、芦丁(批号BCTG-0411,质量分数≥98%),金丝桃苷(批号BCTG-0286,质量分数≥98%)购于中国固体制剂制造技术国家工程研究中心;甲酸(LC-MS,批号A117-50Fisher Scientific,赛默飞世尔科技有限公司),乙腈(AC-1026-4000LCMSACS),乙醇(批号1705021,西陇科学股份有限公司)为色谱纯,水为超纯水,其余为分析纯。

    吴茱萸饮片经江西中医药大学付小梅副教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的干燥近成熟果实,购于江西樟树天齐堂中药饮片有限公司,产地为江西刘公庙五洲村(S1S182016年,S19S282017年,S29S472018年),样品信息见表1

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    2  方法

    2.1  供试品溶液的制备

    取本品粉末(过3号筛)约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,称定重量,浸泡1 h,超声处理(功率300 W,频率40 kHz)40 min,放冷,再称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,过0.22 μm微孔滤膜,即得。

    2.2  对照品溶液的制备

    取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、二氢吴茱萸卡品碱对照品适量,精密称定,分别加入甲醇制成质量浓度为0.4570.2820.4580.2950.4640.6480.4160.2040.5780.2320.2020.334 mg/mL的对照品储备液。取以上12种对照品储备液适量,加甲醇稀释成一定浓度的混合对照品溶液。

    2.3  色谱条件

    色谱柱为Acquity UPLC® BEH C18(2.1 mm×100 mm1.7 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);检测波长330 nm;体积流量0.200 mL/min;进样量0.4 μL;柱温40 ℃;样品温度20 ℃;梯度洗脱程序见表2

    59c33a6629573c20a1ba6ed425a3801e.png 

    2.4  方法学考察

    2.4.1  精密度试验  取混合对照品溶液,按照“2.3项下色谱条件连续进样6次,记录各峰面积。测定结果显示各峰面积的RSD值为0.58%0.86%,符合要求,表明仪器的精密度良好。

    2.4.2  稳定性试验  取同一供试品溶液(批号A1809001-1),分别于供试品溶液制备后的第02481224 h,按照“2.3项下色谱条件进行测定,记录色谱图。测定结果显示各主要峰面积的RSD值为0.34%1.55%,结果表明24 h内供试品溶液的稳定性良好。

    2.4.3  重复性试验  取吴茱萸(批号A1809001-1)粉末约0.3 g,平行6份,分别按照“2.1项下方法制备供试品溶液,按照“2.3项下色谱条件进样测定,记录色谱图。测定结果显示各主要峰面积的RSD0.34%1.52%,表明此方法的重复性良好。

    2.5  数据分析 

    通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)软件对UPLC指纹图谱数据进行处理,确定共有峰,生成对照图谱并进行相似度计算,对部分共有峰进行指认并计算其含量。以各共有峰峰面积为变量,将数据导入SIMCA-14.1软件进行PCAOPLS-DA分析,筛选导致不同年份吴茱萸间差异的化学成分。

    3  结果与分析

    3.1  指纹图谱的构建及共有峰的确定

    按“2.1”项下方法制备各供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样,记录UPLC色谱图,并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)软件,以S1样品色谱图为参照,建立指纹图谱。叠加图及对照指纹图谱见图12

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    3d291794ba5ebd983f50f81508468213.png

    47批吴茱萸样品,共标记了40个共有峰,且共有峰面积占总峰面积的95%以上,符合指纹图谱的相关规定,并对其中12个共有峰成分进行了指认,分别为新绿原酸(峰5)、绿原酸(峰12)、咖啡酸(峰13)、隐绿原酸(峰15)、芦丁(峰21)、金丝桃苷(峰22)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(峰23)、去氢吴茱萸碱(峰28)、吴茱萸碱(峰33)、吴茱萸次碱(峰34)、吴茱萸卡品碱(峰38)、二氢吴茱萸卡品碱(峰40),见图3

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    3.2  吴茱萸样品指纹图谱相似度分析

    采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)软件,以吴茱萸对照指纹图谱为参照,计算相似度,结果见表147批吴茱萸样品与对照指纹图谱的相似度均在0.997以上,表明不同年份间的吴茱萸药材质量稳定。

    3.3  化学模式识别研究

    3.3.1  无监督化学模式识别-PCA47批次吴茱萸样品中40个共有峰峰面积数据导入SIMCA14.1件中,进行主成分分析,前6个主成分的特征值均大于1,累积贡献率达到89.866%,说明前6个因子在反映3种不同年份吴茱萸与40个共有成分的相互关系中起主导作用,能够揭示样品中大多数的差异信息,见表3

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    根据47批吴茱萸样品40个共有峰的PCA结果,提取前4个主成分作得分图,见图4。结果表明,3种不同年份吴茱萸样品在无监督模式的PCA处理下并没有得到很好地区分,为了更好地考察化学模式识别方法能否将不同年份吴茱萸完全区分,进一步采用OPLS-DA法对样品进行分析。

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    3.3.2  有监督化学模式识别—OPLS-DA    47批吴茱萸样品按年份分为3组,第1S1S18(2016年),第2S19S28(2017年),第3S29S47(2018年),通过OPLS-DA分析结果可知,1组与2组区分结果良好,如图5-A所示,模型主成分回归系数:R2X0.738R2Y0.862Q20.7340.52组与3组区分结果良好,如图5-B所示,模型主成分回归系数:R2X0.621R2Y0.773Q20.6880.51组与3组区分结果良好,如图5-C所示,模型主成分回归系数:R2X0.83R2Y0.826Q20.6290.5。以上3组预测模型下Q2均大于0.5,说明OPLS-DA预测模型有效,3组不同年份吴茱萸样品得到较好的区分。

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    通过提取OPLS-DA模型中40个变量的VIP值图(图5-D),对40个共有峰峰面积VIP值大小进行排列,选择VIP值大于1的共有峰,结果显示峰2172912334332031396537419271636323518VIP值均大于1,说明以上22种化学成分对3种不同年份吴茱萸样品分类具有显著的影响,这些成分是引起不同年份吴茱萸变化的主要标志物,其中12号峰为绿原酸,34号峰为吴茱萸次碱,33号峰为吴茱萸碱,5号峰为新绿原酸。其他色谱峰VIP均小于1,对不同年份吴茱萸差异性影响不大。

    3.4  指标性成分含量测定

    3.4.1 线性关系 精密吸取新绿原酸、绿原酸、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品储备液适量,配制成6个质量浓度系列的混合对照品溶液,按照“2.3项下色谱条件进行测定,以对照品质量浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程、相关系数(r)和线性范围,结果见表4

    4caa7ed48158cebe67cb277e5a5f1618.png

    3.4.2  精密度试验  取混合对照品溶液,按照“2.3项下色谱条件连续进样6次,记录各峰面积。测定结果显示各峰面积的RSD值分别为0.72%0.56%0.86%0.72%,表明仪器的精密度良好。

    3.4.3  稳定性试验  取同一供试品溶液(批号A1809001-1),分别于供试品溶液制备后的02481224 h,按照“2.3项下色谱条件进行测定,记录色谱图。测定结果显示各主要峰面积的RSD值分别为0.63%0.53%0.63%0.50%,结果表明24 h内供试品溶液的稳定性良好。

    3.4.4  重复性试验  取吴茱萸(批号A1809001-1)粉末约0.3 g,平行6份,分别按照“2.1项下方法制备供试品溶液,按照“2.3项下色谱条件进样测定,记录色谱图。测定结果显示各主要峰面积的RSD0.62%0.59%0.61%0.48%,表明此方法的重复性良好。

    3.4.5  加样回收率试验  精密称取吴茱萸粉末(批号A1809001-1)6份,每份0.15 g,分别加入新绿原酸、绿原酸、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品0.959 71.2690.797 60.095 1 mg,按“2.1项下方法,制备加样样品溶液,按照“2.3项下色谱条件进行测定,记录峰面积并计算回收率,结果显示新绿原酸、绿原酸、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的回收率分别为101.03%99.93%98.25%99.02%RSD值分别为0.93%1.01%1.14%1.37%

    3.4.6  样品含量测定  通过对47批吴茱萸药材进行色谱分析,测定吴茱萸样品中新绿原酸、绿原酸、吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量,含量测定结果见表5

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    4  讨论

    本实验共指认了吴茱萸中12种化学成分,包含了酚酸(新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸),黄酮(芦丁、金丝桃苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷)和生物碱(去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、二氢吴茱萸卡品碱)3类,但未能检测到《中国药典》2015年版含量测定项下的柠檬苦素类成分,因其为末端吸收,需在215 nm波长附近才有吸收,而在以甲酸水溶液与磷酸水溶液系统为流动相的比较中发现,215nm下甲酸水溶液系统几乎没有成分检出,磷酸水溶液系统虽有检出,但杂质峰较多,基线噪音大,不平稳,严重影响了其他成分的分离及鉴别;通过进行全波长扫描,提取其中215254330 nm等较大吸收波长为检测波长,发现以330 nm波长下的色谱峰数量多,基线波动稳定,各成分分离度良好,杂峰影响较小;再对比甲醇与乙腈的影响,综合选择以乙腈-0.1%甲酸为流动相,330 nm为检测波长最为适宜。

    化学模式识别在中药质量控制中的运用越来越广泛,单一的含量测定与指纹图谱也越来越难以全面合理地反映中药材整体的质量情况,而将其与中药研究相结合,使对中药复杂的多成分鉴别转变为对数据的解析,从而更有利于对中药质量的控制。吴茱萸有小毒,其生物碱和挥发油既是功效成分也是毒性成分,功效与毒性密切相关。临床曾报道因服用新鲜、炮制未透或过量的吴茱萸而导致中毒的案例,因而通过陈放来减少辛辣刺激之性,减轻毒副作用,以“陈久者良”。本实验通过UPLC指纹图谱与化学模式识别模式相结合的方式,可以对不同年份的吴茱萸药材进行有效区分,找出引起其变化的差异性标志物,并通过对其中新绿原酸、绿原酸、吴茱萸碱、吴茱萸次碱成分的含量测定,从多角度更为全面、准确控制药材质量,同时也可为药材的贮藏以及质量优劣的判别提供依据,为“六陈”中药的研究提供新思路。

    参考文献(略) 

    来  源:张崇佩,张依欣,李  潮,袁小平,于  欢,龚千锋. 不同年份吴茱萸UPLC指纹图谱及多成分化学模式识别研究 [J]. 中草药, 2019, 50(11):2700-2707.

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