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  • 非常详细和使用的western blot课件,对于想学习这门技术的本科生、研究生来说是一个不可多得的好课件!
  • Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件:Windows 版本 第一步:软件安装 1. 下载地址:http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html 2. 下载windows 32位带Java版本,双击软件安装。 第二步:界面介绍 ...
  • western-blot

    2013-05-16 15:08:42
    western-blot操作技术,可以为您详细的解释原理和操作的相关注意事项
  • Western Blot 二抗与底物反应显色 ? 辣根过氧化物酶法 HRP ? 碱性磷酸酶法 AP ? 化学发光显色法 (HRP) Western Blot 膜解吸方法膜的重复利用 ? 通过加热和去污剂进行解吸 原理 组合使用去污剂和加热使抗体解离 适用...
  • Western Blot操作步骤多,每个细节的差错都会造成图片不理想,那么怎么跑出漂亮的Western Blot图片?如果你的蛋白分子量大于150KD,但苦于一直跑不出好看的western-blot,那么这篇文章,你一定得看。关注这五个步骤...

        Western Blot操作步骤多,每个细节的差错都会造成图片不理想,那么怎么跑出漂亮的Western Blot图片?如果你的蛋白分子量大于150KD,但苦于一直跑不出好看的western-blot,那么这篇文章,你一定得看。关注这五个步骤细节,教你跑出漂亮的大分子western-blot图,童鞋们赶紧来围观吧!

     

     

    选对凝胶很重要

        3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH还有上升的趋势,可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。

        Bis-Tris凝胶的PH为6.4,相对Tris-Glycine凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如DTT,以维持蛋白的还原性。

        Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。跑大分子蛋白时,我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。

     

    凝胶浓度很重要

        既然选择了Tris-Acetate 凝胶,还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比:浓度越小,孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔,所以我建议使用低百分比的凝胶,如7%。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶,梯度凝胶非常适合新样本。

     

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  • WB(Western Blot)显色方法怎么选?

    千次阅读 2020-11-11 18:42:03
    前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结,问题涉及到WB的各个步骤。其中,封闭和一抗的选择余地不大,二抗的作用是信号扩增,是根据一抗的标记形式而定的。对于无标记一抗,可以选择对应一抗来源...

         前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结,问题涉及到WB的各个步骤。其中,封闭和一抗的选择余地不大,二抗的作用是信号扩增,是根据一抗的标记形式而定的。对于无标记一抗,可以选择对应一抗来源种属的二抗,或者Protein A。不过,二抗更可靠的选择是除了对应一抗的种属来源,还需要根据你选择的检测方法选择合适的标记。

     

    底物显色是最后一步,也是最有文章可做的一步。显色的标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等等,酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择,显色方法多种多样,下面我们针对常用的几类方法进行总结对比分析,供大家方便在以后实验中根据自己需求进行选择。

     

    酶促反应较生物素安全且反应快速,是WB中的主流显色方法。酶促反应根据不同底物显色方法又包括化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高,可以达到pg级,而底物显色由于直接显色而操作简单且成本低。最为大家所熟悉的底物显色当数HRP(辣根过氧化物酶,Horseradish Peroxidase)和AP(碱性磷酸酶,Alkaline Phosphatase)。

     

    HRP

     

    这是最常见的酶促发光或显色的交联酶,由于HRP比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物主要包括化学发光底物和生色底物两大类,对于底物的选择,主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。

     

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  • Western blot 流程和常见问题;主要内容;3; Western Blot实验流程;6;7; 步骤三SDS电泳 ;11;转移操作;13;14;一抗的选择 确定所研究的目的蛋白根据目的蛋白名称查询相关抗体 抗体所检测的种属人小鼠大鼠等;16;步骤七...
  • Western blot 技术

    千次阅读 2020-07-20 00:36:04
    (western blot) 印迹技术 一般是你先实验进行了一个电泳,然后把电泳后的产物(如DNA、蛋白质)通过印迹技术转移到一个膜上,然后使用特异性的能识别此产物的探针或者抗体来识别,从而检测产物。广泛应用于DNA、RNA...

    (western blot)

    印迹技术

    一般是你先实验进行了一个电泳,然后把电泳后的产物(如DNA、蛋白质)通过印迹技术转移到一个膜上,然后使用特异性的能识别此产物的探针或者抗体来识别,从而检测产物。广泛应用于DNA、RNA、蛋白和抗原等。

    Western Blot 实验

    今天记录一下western blot的实验操作步骤及注意事项。

    背景理论

    将待检测蛋白质(或酶)经SDS-PAGE电泳后,转移到固相载体上,再用“抗体-抗原”免疫反应 或 “DNA-蛋白质”结合反应,鉴别膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量与相互作用研究,分析基因的表达程度。

    检测方法:①放射自显影 ②偶联反应+显色(光化学)反应

    实验过程

    SDS-PAGE——转膜——封闭——检测。

    SDS-PAGE

    1、来到Lab,首先把实验用跑胶玻璃板洗干净烘干。

    2、配电泳液,一般向内槽中加入250ml即可。
    缓冲液250ml:225ml ddH2O + 25ml 10xTris甘氨酸电泳液
    将胶板固定好。

    3、配胶
    一块1.0厚玻板,一般需要分离胶5ml,浓缩胶2ml。

    分离胶:选择合适浓度,按照比例加入各组分。
    1ml=1000μl

    ddH2O
    30%丙烯酰胺(30%Acr/Bis制胶液)
    1.5M Tris-HCl(pH8.8)
    10%SDS
    10%APS
    TEMED(即PAGE胶促凝剂) 最后加入

    防止向玻板间加胶时胶已凝固,所以配的分离胶要不断轻轻摇晃,并在1-2min内把胶加好

    向玻板间加入分离胶5ml,加时尽量避免气泡。再向分离胶间加入1-2ml ddH2O,将分离胶压平稳。加水时注意轻轻缓慢加入。分离胶干后,倒出ddH2O,用吸水纸将残留的水吸干净。下一步加浓缩胶。

    浓缩胶:按比例加入各组分
    ddH2O
    30%丙烯酰胺(30%Acr/Bis制胶液)
    1.0M Tris-HCl(pH6.8)
    10%SDS
    10%APS
    TEMED(即PAGE胶促凝剂) 最后加入
    配好浓缩胶后轻混匀,即刻加入到胶板的分离胶上面,加入2ml,插入梳子,等待其凝固。

    浓缩胶凝固后,清洗干净玻板表面,竖直拔下梳子。

    短玻板向内侧,推严实夹紧玻璃板,固定好胶架,正极对正极,负极对负极,放入电泳槽内。

    向电泳槽内加入电泳液,加入量要溢出加满,上面尽量无气泡。

    一般加Marker 10μl,加样品 20μl。
    盖上电极盖子。起始设置电压80v,待样品跑完浓缩胶,进入分离胶后,电压调整为120v。(140v、160v可根据试验需求,适当调整)

    转膜

    待样品跑完整块凝胶后,停止电泳,将内槽液体丢弃(防止蛋白有溢出,再次用可能会交叉污染)。

    将凝胶取下,切去浓缩胶,剩余分离胶部分,泡入转膜工作液中,
    滤纸—泡入转膜工作液,PVDF膜,先用甲醇(乙醇)活化30s,再放入转膜工作液中。

    放置顺序
    负极
    ———— 滤纸
    ———— 凝胶
    ———— PVDF膜
    ———— 滤纸
    正极

    凝胶上的蛋白带负电,向正极方向转移,从而转移到PVDF膜上

    转膜缓冲液(10x)1L : Tris 30.3g + 甘氨酸144g + 不调pH值
    转膜工作液(1x) 1L :10x转膜缓冲液100ml + 甲醇(无水乙醇)200ml + ddH2O 补齐到1L。

    向槽内加入转膜工作液。将印迹槽放入到泡沫箱中,盖上电极盖子。周围加冰水混合物覆盖降温,防止产热过多。

    转膜恒流。可设置300mA,60min,转膜电流与时间的设置可调整。转膜开始。

    从封闭起的所有步骤,PVDF膜一定要保湿,不要使其离开液体环境太久,否则极易产生很高的背景,加液换液要迅速

    封闭

    取出转膜完成的PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭15-30min。

    倒掉脱脂奶粉,加入一抗,振摇1h,吸出一抗。

    PBST振摇漂洗3次,每次10min,吸出漂洗液。

    加入二抗,振摇速度以液面轻晃为宜,孵育50-60min,吸出二抗。

    PBST振摇漂洗3次,每次10min,吸出漂洗液。

    PBST:PBS + 吐温20,吐温20的终浓度为0.05%(体积比)。即2L PBST配制:需要 2000ml X 0.05% = 1ml 吐温20。

    检测

    将PVDF膜取出,竖直用吸水纸吸吸水分,放置在成像板上,滴加ECL化学发光剂于膜上(全覆盖均匀)。选择程序20帧30s,化学发光,曝光,成像,读取结果。

    5%脱脂奶粉:2.5g脱脂奶粉→50ml PBST中

    一抗:按说明书稀释,一般一抗稀释1000倍,用PBS稀释(可反复使用多次),或用脱脂奶粉稀释(反复用不久)。

    二抗:按说明书稀释,一般稀释4000-5000倍,用PBST稀释。

    ECL化学发光试剂:白瓶+黑瓶,现用现配,1:1比例配用。
    一般一张膜 250μl 即够用。
    配制方法:白瓶 250μl + 黑瓶 250μl,混匀,直接取 250μl 滴加到成像板上的PVDF膜上。

    附上分离胶/浓缩胶常用配制浓度及体积
    在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述

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  • western blot总结前人的经验[宣讲].pptx
  • western blot 显影 定影

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    素闻Python  matplotlib 绘图功能强大,特地在网上搜索资源尝试了一下,综合各位大神的笔记,编写了一个绘制western blot表达量柱状图的小程序


    #!coding:utf-8
    import numpy as np #导入numpy函数  
    import matplotlib.pyplot as plt  #导入matplotlib函数

    n_groups = 3  #设定初始值
    zh = [1, 1,1 ]  #数据1  
    fh = [3.20,3.88,3.64] #数据2
    eh = [2.9,4.7,3.65]
    err1 = [0,0,0] #数据1的标准差
    err2 = [0.44,0.38,0.32]  #数据2的标准差
    err3 = [0.38,0.33,0.61]
    ax = plt.subplot(1,1,1)  #设定图像长宽高
    ax.spines['right'].set_visible(True)  #Flase为取消右侧线条
    ax.spines['top'].set_visible(True)  #Flase为取消顶部线条
    ax.spines['bottom'].set_linewidth(1.5)  #设置x轴的粗细
    ax.spines['left'].set_linewidth(1.5)  #设置y轴的粗细
    index = np.arange(n_groups)  #生成【0,1,2,3,4】数组
    bar_width = 0.2  #柱状图宽度
    opacity = 0.5   #透明度
    rects1 = plt.bar(index, zh, bar_width,yerr=err1,capsize=8,alpha=opacity, color='k',ls='-', lw=1,ec='k') #rects1 = plt.bar(i
    ndex (x轴位置), means_men(y轴位置), bar_width(柱状图宽度),yerr=err1(误差),capsize=8(误差顶端横杠),alpha=opacity(透明度), color='b'(柱状图颜色),ls='-'(柱状图外围线), lw=1(线宽度),ec='k'(线颜色)ecolor = ‘"r"误差线颜色

    rects2 = plt.bar(index + bar_width, fh,bar_width,yerr=err2,capsize=8,alpha=opacity,color='b',ls='-', lw=1,ec='k')
    rects3 = plt.bar(index + 2*bar_width, eh,bar_width,yerr=err3,capsize=8,alpha=opacity,color='r',ls='-', lw=1,ec='k')
    plt.legend(labels = ['Guy11',r'$\Delta$''MoVps9',r'$\Delta$''MoVps9'r'$\Delta$''MoMuk1' ],fontsize = 12,loc = 'upper right')
    #(labels(图例) = ['men'(图例1),'women'(图例2)],fontsize = 12(图例大小),loc = 'upper right'(图例位置))
    plt.xlabel('',fontsize = 17)  #横坐标标签 字体大小
    plt.ylabel('MoATG8 related expression',fontsize = 17)  #纵坐标标签 字体类型 大小
    plt.xticks(index+bar_width,('0h', '4h', '8h',),fontsize = 17)  #图表x坐标值 为了让坐标值在中间,数组加柱状图的1/2, 字体大小
      

    plt.ylim(0,7)   #纵坐标的取值范围
    plt.tight_layout()  #紧凑图表
    plt.show()  #显示图表

    #


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空空如也

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