精华内容
下载资源
问答
  • Western Blot

    千次阅读 2008-07-24 15:13:00
    Western Blot Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。(1) 原理与...

    Western Blot

     Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

    (1) 原理
    与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

    (2) 分类
    western显色的方法主要有以下几种:
    i. 放射自显影
    ii. 底物化学发光ECL
    iii. 底物荧光ECF
    iv. 底物DAB呈色
    现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。 

    (3) 主要试剂
    1、 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至 100ml。)储于棕色瓶,4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。
    2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去离子水配制,室温保存。
    3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
    4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中,用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,而不用 Tris.CL。
    5、 TEMED原溶液N,N,N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时,聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml,临用前配制.
    6、 SDS- PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,巯基乙醇3.2ml,0.05%溴酚蓝1.6ml,H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。
    7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸馏水溶解至1000ml,得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
    8、 转移缓冲液:配制1L转移缓冲液,需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。
    9、 丽春红染液储存液:丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
    10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
    11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒,戴手套操作),溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
    12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl。
    13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
    14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
    15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。
    16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)。
    17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
    18、 100mmol/L NaCl。
    19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA。
    (可以参看分子克隆)

    (4) 主要程序
    在这主要列举了一些网站上的有关Western Blot的英文资料,读者可以根据自己实验室的实际情况进行调整:
    Western Blot PROTOCOL:
     

    1、     Preparation of Brain Membrane Fractions for Western Blot

    2、     Western Blotting

    3、     Western Blots

    4、     Western Blotting

    5、     General Western Blot Protocol

    6、     Western Blot & Immunostaining  

    7、     Western Blot Analysis for Tissue

    8、     Western Blotting

    9、     ECM Protocols Western Blot

    10、 Western Blotting Using Chemilμminscence  

    11、 Far Western Blotting

    12、 Enzyme-Assisted Immunoelectroblotitng

    13、 Western Trouble Shooting

    14、 Too Many Bands on Western Blot

    Tips and hints for the storage of antibodies

     

    转载自 生命经纬

    展开全文
  • Western blot 技术

    千次阅读 2020-07-20 00:36:04
    (western blot) 印迹技术 一般是你先实验进行了一个电泳,然后把电泳后的产物(如DNA、蛋白质)通过印迹技术转移到一个膜上,然后使用特异性的能识别此产物的探针或者抗体来识别,从而检测产物。广泛应用于DNA、RNA...

    (western blot)

    印迹技术

    一般是你先实验进行了一个电泳,然后把电泳后的产物(如DNA、蛋白质)通过印迹技术转移到一个膜上,然后使用特异性的能识别此产物的探针或者抗体来识别,从而检测产物。广泛应用于DNA、RNA、蛋白和抗原等。

    Western Blot 实验

    今天记录一下western blot的实验操作步骤及注意事项。

    背景理论

    将待检测蛋白质(或酶)经SDS-PAGE电泳后,转移到固相载体上,再用“抗体-抗原”免疫反应 或 “DNA-蛋白质”结合反应,鉴别膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量与相互作用研究,分析基因的表达程度。

    检测方法:①放射自显影 ②偶联反应+显色(光化学)反应

    实验过程

    SDS-PAGE——转膜——封闭——检测。

    SDS-PAGE

    1、来到Lab,首先把实验用跑胶玻璃板洗干净烘干。

    2、配电泳液,一般向内槽中加入250ml即可。
    缓冲液250ml:225ml ddH2O + 25ml 10xTris甘氨酸电泳液
    将胶板固定好。

    3、配胶
    一块1.0厚玻板,一般需要分离胶5ml,浓缩胶2ml。

    分离胶:选择合适浓度,按照比例加入各组分。
    1ml=1000μl

    ddH2O
    30%丙烯酰胺(30%Acr/Bis制胶液)
    1.5M Tris-HCl(pH8.8)
    10%SDS
    10%APS
    TEMED(即PAGE胶促凝剂) 最后加入

    防止向玻板间加胶时胶已凝固,所以配的分离胶要不断轻轻摇晃,并在1-2min内把胶加好

    向玻板间加入分离胶5ml,加时尽量避免气泡。再向分离胶间加入1-2ml ddH2O,将分离胶压平稳。加水时注意轻轻缓慢加入。分离胶干后,倒出ddH2O,用吸水纸将残留的水吸干净。下一步加浓缩胶。

    浓缩胶:按比例加入各组分
    ddH2O
    30%丙烯酰胺(30%Acr/Bis制胶液)
    1.0M Tris-HCl(pH6.8)
    10%SDS
    10%APS
    TEMED(即PAGE胶促凝剂) 最后加入
    配好浓缩胶后轻混匀,即刻加入到胶板的分离胶上面,加入2ml,插入梳子,等待其凝固。

    浓缩胶凝固后,清洗干净玻板表面,竖直拔下梳子。

    短玻板向内侧,推严实夹紧玻璃板,固定好胶架,正极对正极,负极对负极,放入电泳槽内。

    向电泳槽内加入电泳液,加入量要溢出加满,上面尽量无气泡。

    一般加Marker 10μl,加样品 20μl。
    盖上电极盖子。起始设置电压80v,待样品跑完浓缩胶,进入分离胶后,电压调整为120v。(140v、160v可根据试验需求,适当调整)

    转膜

    待样品跑完整块凝胶后,停止电泳,将内槽液体丢弃(防止蛋白有溢出,再次用可能会交叉污染)。

    将凝胶取下,切去浓缩胶,剩余分离胶部分,泡入转膜工作液中,
    滤纸—泡入转膜工作液,PVDF膜,先用甲醇(乙醇)活化30s,再放入转膜工作液中。

    放置顺序
    负极
    ———— 滤纸
    ———— 凝胶
    ———— PVDF膜
    ———— 滤纸
    正极

    凝胶上的蛋白带负电,向正极方向转移,从而转移到PVDF膜上

    转膜缓冲液(10x)1L : Tris 30.3g + 甘氨酸144g + 不调pH值
    转膜工作液(1x) 1L :10x转膜缓冲液100ml + 甲醇(无水乙醇)200ml + ddH2O 补齐到1L。

    向槽内加入转膜工作液。将印迹槽放入到泡沫箱中,盖上电极盖子。周围加冰水混合物覆盖降温,防止产热过多。

    转膜恒流。可设置300mA,60min,转膜电流与时间的设置可调整。转膜开始。

    从封闭起的所有步骤,PVDF膜一定要保湿,不要使其离开液体环境太久,否则极易产生很高的背景,加液换液要迅速

    封闭

    取出转膜完成的PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭15-30min。

    倒掉脱脂奶粉,加入一抗,振摇1h,吸出一抗。

    PBST振摇漂洗3次,每次10min,吸出漂洗液。

    加入二抗,振摇速度以液面轻晃为宜,孵育50-60min,吸出二抗。

    PBST振摇漂洗3次,每次10min,吸出漂洗液。

    PBST:PBS + 吐温20,吐温20的终浓度为0.05%(体积比)。即2L PBST配制:需要 2000ml X 0.05% = 1ml 吐温20。

    检测

    将PVDF膜取出,竖直用吸水纸吸吸水分,放置在成像板上,滴加ECL化学发光剂于膜上(全覆盖均匀)。选择程序20帧30s,化学发光,曝光,成像,读取结果。

    5%脱脂奶粉:2.5g脱脂奶粉→50ml PBST中

    一抗:按说明书稀释,一般一抗稀释1000倍,用PBS稀释(可反复使用多次),或用脱脂奶粉稀释(反复用不久)。

    二抗:按说明书稀释,一般稀释4000-5000倍,用PBST稀释。

    ECL化学发光试剂:白瓶+黑瓶,现用现配,1:1比例配用。
    一般一张膜 250μl 即够用。
    配制方法:白瓶 250μl + 黑瓶 250μl,混匀,直接取 250μl 滴加到成像板上的PVDF膜上。

    附上分离胶/浓缩胶常用配制浓度及体积
    在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述在这里插入图片描述

    展开全文
  • western-blot

    2013-05-16 15:08:42
    western-blot操作技术,可以为您详细的解释原理和操作的相关注意事项
  • 非常详细和使用的western blot课件,对于想学习这门技术的本科生、研究生来说是一个不可多得的好课件!
  • 疯牛病和羊痒病WESTERN BLOT检测方法的建立,王辉暖,赵德明,以朊蛋白单抗AH6和碱性磷酸酶标记的酶标马抗鼠二抗建立了疯牛病和羊痒病的Western Blot检测方法。对Western Blot 各种反应条件进行摸索,�
  • 大麦Western-blot内参蛋白的选择与应用,王容,李博,比较了六种总蛋白提取法提取大麦不同器官总蛋白质效果的差异,结果表明Tris法、直接法和改良TCA法分别适合提取大麦种子、幼嫩组织�
  • western blot 显影 定影

    2013-06-03 20:54:57
    详细讲解了显影定影的作用,感光片在制作过程中主要程序如下: 建立潜像于感光片上——曝光;变潜像为可见影像—显影;稳定可见影像—定影
  • Western Blot操作步骤多,每个细节的差错都会造成图片不理想,那么怎么跑出漂亮的Western Blot图片?如果你的蛋白分子量大于150KD,但苦于一直跑不出好看的western-blot,那么这篇文章,你一定得看。关注这五个步骤...

        Western Blot操作步骤多,每个细节的差错都会造成图片不理想,那么怎么跑出漂亮的Western Blot图片?如果你的蛋白分子量大于150KD,但苦于一直跑不出好看的western-blot,那么这篇文章,你一定得看。关注这五个步骤细节,教你跑出漂亮的大分子western-blot图,童鞋们赶紧来围观吧!

     

     

    选对凝胶很重要

        3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH还有上升的趋势,可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。

        Bis-Tris凝胶的PH为6.4,相对Tris-Glycine凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如DTT,以维持蛋白的还原性。

        Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。跑大分子蛋白时,我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。

     

    凝胶浓度很重要

        既然选择了Tris-Acetate 凝胶,还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比:浓度越小,孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔,所以我建议使用低百分比的凝胶,如7%。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶,梯度凝胶非常适合新样本。

     

    文章剩余内容<<<

    展开全文
  • western blot常用于生物学实验中蛋白质的定性或者定量。进行定量分析时,需要扫描蛋白灰度,虽然有一些现成的工具或软件能完成这个任务,但我想试试python能不能更方便的完成。

    一、原理与思路

    图像由无数的像数构成,python读取图片每一像数点的灰度值,从黑-白的灰度值为0~255,即越黑的地方灰度值越小,越白的地方灰度值越大。显然,我们希望越黑的地方灰度值越大,因此需要做一个反转,即用255减去各个像数点灰度值。接着,将所有非条带部分的像数点灰度值改为0,而蛋白条带部分灰度值保持不变。最后,只要识别出每个蛋白条带的区域,将其中所有像数点灰度值和。

    图1  示例图像

     

    二、python代码

    # 导入模块
    
    from numpy import *
    
    from PIL import Image
    
    # 构建一个函数读取灰度值图像
    
    def pictureRead(path):  # path为图片文件路径
    
        im = array(Image.open(path).convert('L'))
    
        im = 255 - im  # 黑白灰度值转换
    
        # 白色部分灰度值转换为0,黑色部分保持原值
    
        row, col = im.shape
    
        for i in range(row):
    
            for j in range(col):
    
                if im[i,j] < 128:
    
                    im[i,j] = 0
    
        return im
    
    # 构建一个函数识别蛋白条带区域
    
    def discern(array):
    
        list = []
    
        array = 1 * (array > 128) # 转换为二值图像,白色为0,黑色为1
    
        # 对每一列像素值求和,若与前一列结果不一致则判断为条带边缘
    
        row, col = array.shape
    
        for i in range(col):
    
            if (sum(array[:,i]) == 0) != (sum(array[:,i-1])==0):
    
                list.append(i)
    
        return list
    
    # 构建一个函数求和各条带灰度值
    
    def greySum(array, list):
    
        sumlist = []
    
        for i in range(len(list)):
    
            if i % 2 ==0:
    
                sum = array[:,list[i]:list[i+1]].sum()
    
                sumlist.append(sum)
    
        return sumlist
    
    #  运行
    
    if __name__ == '__main__':
    
        path = r'C:\test.png'
    
        im = pictureRead(path)
    
        list = discern(im)
    
        area = greySum(im,list)
    
        print(area)

    三、代码解析

    1)导入模块

    程序运行需要导入numpy和PIL模块,如果你的python还未安装这两个模块,程序出错。

    2)pictureRead()函数

    pictureRead()函数用于读取图像,并进行一些转换操作。这个函数需要您提供一个图像文件路径的字符串参数path(如示例所示),经这一步处理后图像如下:

    图2  

    图2中,蛋白条带轮廓清晰可见,但是示例图像中第一条很浅的条带消失了,这是函数中把灰度值小于128的像数点都改为0了,所以太浅的条带,此程序可能无法扫描,或者您可以试着把128调低,看看能否把较浅的条带识别出来。

    3)discern()函数

    discern()函数先将灰度图像转换成二值图像,用于识别条带左右边缘,转换后的二值图像如下:

    图3

    此函数返回一个列表,此例为:[76, 128, 134, 183, 194, 245, 249, 302],第1、2个值为第一个条带左右边缘的列下标,第3、4个为第二个条带左右边缘的列下标,依次类推。

    4)greySum()函数

    根据discern()函数获得的列表信息,对图2的灰度图像的蛋白条带区域灰度值求和。

    最后结果返回一个列表:[166251, 100107, 129382, 158781]即表示各条带灰度值


    四、局限性

    1)扫描灰度值的图像,蛋白条带间不要连在一块,否则将视为一个条带。

    2)蛋白条带灰度太低无法识别,需做修改。

    3)结果可靠性有待评价,可与其他工具相比较。

    展开全文
  • 定量western blot 一定要有内参质控(上)Western Blot是生物修炼的一大实验,现在不做定量Western Blot,都不敢自诩学霸的了,暗暗擦汗的有没有?在讨论如何从Western Blot中获得定量数据之前,先定义一下我们所说的...
  • 素闻Python matplotlib 绘图功能强大,特地在网上搜索资源尝试了一下,综合各位大神的笔记,编写了一个绘制绘制western blot表达量柱状图的小程序 #!coding:utf-8 import numpy as np #导入numpy函数 import ...
  • Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件:Windows 版本 第一步:软件安装 1. 下载地址:http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html 2. 下载windows 32位带Java版本,双击软件安装。 第二步:界面介绍 ...
  • 前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结,问题涉及到WB的各个步骤。其中,封闭和一抗的选择余地不大,二抗的作用是信号扩增,是根据一抗的标记形式而定的。对于无标记一抗,可以选择对应一抗来源...
  • mage J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析 原文mage J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析 WB是研究蛋白表达的一个经典方法。对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量...
  • 正所谓:爱也WB(顺利一跑就跑出来了),恨也WB(不顺利作死的也跑不出)。...春风学院Western blot 课程,理论介绍+实操视频:http://weike.fm/xq3Uqff33下面就简单介绍下WB实验技术:1. Western ...
  • JSRV囊膜基因全长的抗原表位预测、原核表达与western-blot 鉴定,徐斯日古楞,刘月,目的:为了制备绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的单克隆抗体和进一步体外研究囊膜蛋白在绵羊肺腺瘤病致瘤中的可能作用。方法:采用生物信
  • Image-J和Graphpad如何对Western-Blot条带灰度分析 精品文档 精品文档 收集于网络如有侵权请联系管理员删除 收集于网络如有侵权请联系管理员删除 精品文档 收集于网络如有侵权请联系管理员删除 Image J和Graphpad...
  • 欢迎分享本文到朋友圈,文章转载、投稿、业务合作联系请微信Havana90~~Western blot可以用于蛋白含量的测定,对其进行(半)定量分析。我们在论文中经常会看到除了Western blot条带图片之外,还会附带一个条带量化分析...
  • ”“连Western blot都没学好,又让我学Image J,我......”Image J分析蛋白条带灰度值 首先解释一下,为什么要分析灰度值?灰度的概念是使用黑色调表示物体,即用黑色为基准色,不同的饱和度的黑色来显示图像。采用...
  • 医学 骨科 考额分分分研 贺银城 学习 学生 测愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤医学 骨科 考额分分分研 贺银城 学习 学生 测愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤愤
  • 鉴于在有些已发表的学术论文中,部分Western blot结果被认为存在不正当修饰,产生了诸多负面影响。那么,作为PI,如何才能识别自己实验室的WB图片是否存在不正当修改的情况,或证明完美实验结果的真实性,从而避免被...
  • ”“连Western blot都没学好,又让我学Image J,我......”Image J分析蛋白条带灰度值 首先解释一下,为什么要分析灰度值?灰度的概念是使用黑色调表示物体,即用黑色为基准色,不同的饱和度的黑色来显示图像。采用...
  • WB 实验在提取完蛋白质后,就要对蛋白含量进行测定测定方法如下:一、制作标准曲线1、从-20℃ 取出 1 mg/ml BSA,室温融化后,备用。2、取 18 个 1.5 ml 离心管,3 个一组,分别标记为 0 μg,2.5 μg,5.0 μg ,...
  • 摘要手把手教你利用Image J和Graphpad软件对Western Blot条带进行灰度分析和柱状图构建,看艾美捷干货分享。WB是研究蛋白表达的一个经典方法。对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。一些...
  • 原标题:发文章怎样让Western blot图更好看?第三招教你用Graphpad软件进行统计分析大家好,前面我们介绍了 以及 的定量,那么拿到灰度定量值之后,我们怎样进行下一步的处理呢?今天继续为大家介绍运用Graphpad统计...
  • Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。灰度值越小物体颜色越深。光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线...
  • Image J 和传统软件不太一样,它把标题栏、菜单栏、工具栏和状态栏集中放在一起,... 科研人员做的western blot实验一般需要对其结果扫描后进行灰度分析,一般使用的软件为Image J,搜索免费的资源下载后就可以使用喽。
  • Image J 和传统软件不太一样,它把标题栏、菜单栏、工具栏和状态栏集中放在一起,... 科研人员做的western blot实验一般需要对其结果扫描后进行灰度分析,一般使用的软件为Image J,搜索免费的资源下载后就可以使用喽。

空空如也

空空如也

1 2 3 4 5 ... 7
收藏数 126
精华内容 50
关键字:

blotwestern