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  • 一、检验方法验证的基本内容 检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批,检测仪器的确认。 适用性验证(包括准确度试验、精密度测定、线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个的方面。 二、检验方法...

    一、检验方法验证的基本内容
    检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批,检测仪器的确认。
    适用性验证(包括准确度试验、精密度测定、线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个的方面。

    二、检验方法验证的基本步骤
    首先是制定验证方案,然后对大型精密仪器进行确认,最关键的一步是检验方法的适用性试验,最后是检验方法评价及批准。

    1、验证方案的制定
    检验方法的验证方案通常由质量验证小组提出。根据产品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有关资料,提出规格标准,确定检查项目,规定杂质限度,即为质量标准草案。
    根据质量标准草案确定检查和试验范围,对检验方法拟定具体操作步骤,最后经有关人员审批方可实施。

    2、大型精密仪器的确认
    分析测试中所用的检测仪器一般可分为三类:
    A、普通仪器:崩解仪,折光仪、分析天平、酸度计、溶点测定仪、电导仪等:
    B、较精密仪器:旋光仪、永停滴定仪、费休氏水分测定仪、 自动滴定仪、药物溶出度仪、可见分光光度计、电泳仪等;
    C、大型精密仪器:紫外分光光度计、红外分光光度计、气相色谱仪、高效液相色谱仪、薄层扫描仪等。
    为了保证分析测试数据准确可靠,每台检测仪器在投入正式使用之前都应进行确认。
    检测仪器的确认是检验方法验证的基础,应在其它验证试验开始之前首先完成。
    检测仪器确认工作内容应根据仪器类型。技术性能而定,通常包括:安装确认、校正、适用性预试验和再确认。

    3、校正
    校正是仪器确认及检验方法验证中的一个重要环节,应当在验证试验以前进行校正。紫外分光光度计校正包括波长校正、吸收度测试、准确度测试、杂散光检查。
    气相色谱仪与高效液相色谱仪均要求做系统适用性试验。在规定的色谱条件下测定色谱柱的最小理论塔板数。分离度和拖尾因子,并规定变异系数应不大于2%。
    对于化学检验中使用的计量仪器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均应校正。

    4、适用性预试验
    仪器的安装确认完成以后,在其功能试验符合要求的情况下,应用标准品或对照品对其进行适用性检查,以确认仪器是否符合使用要求。
    例如对熔点测定仪的适用性预试验是采用已知溶点的甲硝唑做试验,测试结果与已知熔点比较。
    紫外分光光度计可用已知含量的某标准品试验,测得结果与已知数值对比,确定仪器是否符合使用要求。
    在完成上述各项试验工作的同时,应做好相应的文件记录等资料归档工作,每一台仪器均应有一套完整的档案资料。

    5、再确认
    为了确保仪器处于良好的使用状态,对于一台新购买的仪器在确认工作结束以后,应根据仪器的类别。确认的经验制定再确认的计划。
    再确认的时间间隔和内容要根据仪器类别和使用情况决定,一般是3个月、6个月或1年。
    仪器再确认的内容通常包括线路连接、附件备品消耗检查、清洁工作、功能试验、工作日记等,其中重点安装确认中的功能试验。

    三、检验方法的适用性验证
    药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应的检测要求。
    在起草药品质量标准时,分析方法需经验证:在药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时,则质量标准分析方法也需进行验证。
    方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草或修订说明中。
    根据《中国药典》附录XIXA的原则要求,检验方法的验证可分为三种情况处理;
    1、无需验证的方法。如药典(包括USP、EP、CP、JP等各国药典)的方法,一般只做系统适用性试验,以确认系统是否符合要求(主要指仪器稳定性及柱的分离度是否达标)。
    2、对比法。已在参比实验室验证过的分析方法,可用对比试验的方法来确认方法的可靠性,即将本实验室与参比实验室用同一方法对同批样品所测数据进行比较(如至少取五个批号,每批重复测定五次),判断方法在本实验室的可行性。
    如有差异需查明原因或设计方案,对方法进行再验证。
    3、需进行系统验证的方法。

    四、检验方法的评价及批准
    安装确认及适用性试验结束后,应将试验数据资料进行汇总分析。对检验方法作出正确的评价,验证报告的说明及结论部分应简明扼要。
    试验中的主要偏差应有适当解释。然后,报主管领导审批。检验方法验证的最终产物是一个经过验证的方法—根据验证的结果制订的由有关领导批准的检验方法。

    五、如何详细计算检出限?
    在如何正确或准确地估算检出限的问题上,国际分析界一直存有争议。检出限的特殊意义在于可以对一个给定的分析方法在低浓度水平的检测能力进行准确地评估,而考察一个分析方法在低浓度范围的检测性能,可以基于不同的角度或不同的侧重点,如可以从最小信号值与仪器噪音之比来考察,从方法测定空白的平均波动性来统计估算,也可以根据分析方法校准曲线的偏差特性来定量估算等等。
    检出限是评价一个分析方法及测试仪器性能的重要指标,所谓“检出”是指定性检出,即判定样品中存在有浓度高于空白的待测物质。
    ACS(美国化学学会)对这一定义作了更简明的概括:检出限是一个分析方法能够可靠地检测出被分析物的最低浓度。

    1、检测限(limit of detection, LOD)定义:
    在样品中能检出的被测组分的最低浓度(量)称为检测限,即产生信号(峰高)为基线噪音标准差k倍时的样品浓度,一般为信噪比(S/N)2:1或3:1时的浓度,对其测定的准确度和精密度没有确定的要求。目前,一般将检测限定义为信噪比(S/N)3:1时的浓度。

    2、计算公式为:
    D=3N/S (1)
    式中:N——噪音; S——检测器灵敏度;D——检测限
    而灵敏度的计算公式为:
    S=I/Q (2)
    式中:S——灵敏度;I——信号响应值;Q——进样量
    将式(1)和式(2)合并,得到下式:
    D=3N×Q/I (3)
    式中:Q——进样量;N——噪音;I——信号响应值。I/N即为该进样量下的信噪比(S/N),该信噪比可通过工作站对图谱进行自动分析获得,一般的色谱或质谱工作站都可进行信噪比分析计算。这样检测限的计算方法就变得非常方便了。

    3、计算方法:
    实际计算时,检出限有2种表示方法:一种是进样瓶中样品检测限,一种是针对原始样品的方法检出限。
    A、对第一种检测限,只要知道进样量和信噪比即可计算。如进样瓶中样品浓度为1 mg/L,在此浓度下的信噪比为300(由工作站分析获得),则其检测限为:D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也可用绝对进样量表示,若进样体积为10 ul,则其检测限为:D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。
    B、对第二种表示方法,需同时考虑原始样品的取样量和提取样品的定容体积。仍按前述样品计算,若取样量为5克,最后定容体积为5 mL,则方法检测限为:D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。
    即当原始样品中待检物质的浓度为0.01mg/kg时,若取样量为5g,样品经前处理后定容体积为5mL时,进样瓶中样品的浓度可达0.01mg/L(假定回收率为100%),此时,在其它给定的分析条件下,能产生3倍噪声强度的信号。在实际检测工作中,第二种表示方法更为常见。
    4、注意事项
    由式(3)可见,信噪比的大小直接关系到检测限的大小。信噪比计算方法的不同,其比值大小有很大不同,这与计算信噪比时基线噪声峰值的定义方式有关,一般有三种不同的定义:
    A、峰/峰(peak to peak)信噪比,用某一段基线噪声的平均高度;
    B、峰/半峰(half peak to peak)信噪比, 用某一段基线噪声平均高度的1/2;
    C、均方根(RMS)信噪比,用某一段基线噪声的均方根值计算。
    除此之外,信噪比的计算结果还和所取噪声的位置有很大关系,取信号哪一侧基线的噪声,取多长一段基线上的噪声,计算结果都很不完全相同,有时相差甚远。一般多取样品峰两侧的噪声峰值计算。
    5、检出限的确定
    A、《全球环境监测系统水监测操作指南》中规定:给定置信水平为95%时,样品测定值与零浓度样品的电冰箱3C认证测定值有显著性差异即为检出限:
    L = 4.6Sb
    式中:L——方法的最低检出浓度。
    Sb ——测定次数为n次的空白平行测定(批内)标准差(重复测定20次以上)。
    B、国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)规定对各种光学分析方法,可用下式计算:
    L = KSb/S
    L——方法的最低检出浓度
    Sb——空白多次测量的标准偏差(吸光度);
    S ——方法的灵敏度(即校准曲线的斜率)
    为了评估 ,空白测定次数必须足够多,最好能测20次。国际纯粹和应用化学联合会极力提倡取k值为3,一般来说,取 相应的置信水平大约为90%。
    若 =0,并不意味着 ,或检出限无限小。这时需配制一个浓度略大于零浓度的试样系列(能产生一个可测信号值)代替全程序空白试验,求出其标准偏差,用来代替 。
    此外,有时为了工作方便和便于比较,也规定一个大家能接受的信号值作为检出限,如分光光度法中,规定吸光度为0.010所对应的浓度即为检出限L。
    C、 美国EPA SW—846规定方法中的检出限为:
    L=3.143Sb
    D、某些分光光度法是以吸光度(扣除空白)为0.010相对应的浓度值或绝对量为检出限,这是一种实验室间的协定方案。
    E、气相色谱法:检测器恰能产生与噪音相区别的响应信号时所需进入色谱的物质最小量为检出限,一般为噪音的二倍。
    F、离子选择电极法:当校准曲线的直线部分外延的延长线与通过空白电位且平行于浓度轴的直线相交时,其交点所对应的浓度值即为该离子色谱所对电极法的检出限。
    由测得的空白值计算出的L值不应大于分析方法规定的最低检出浓度值,如大于方法规定值时,必须寻找原因降低空白值,重新测定计算至合格。

    6、校正曲线绘制:
    A、按分析方法步骤,通过实测浓度和仪器信号值的直线关系,确定实验室条件下的测定上限。当测定上限低于方法的检测上限时,只能用实测的直线范围。
    B、绘制校正曲线的分析步骤应与样品分析相同,并且不少于5个浓度值。
    C、校正曲线绘制与每批测定样品同时进行,对某些分析方法的校正曲线的斜率稳定,批间误差较小,使用原制校正曲线时,应与样品同时测定2份中等浓度标样和2份空白的平行样。
    测得标准的浓度(减去空白)值与原校正曲线相对应的浓度值的相对偏差,分光光度应小于5%;原子吸收法应小于10%,否则重新制作校正曲线。

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  • 利用慧创近红外设备NirScan探讨针灸得气对前额叶-运动皮层网络的血流动力反应和功能连接的调节作用的研究 针灸,一种外部神经调节方法,可平衡交感神经和副交感神经活动并调节人脑 针灸刺激过程中,来自周围神经...

    文中不同彩色笔记表示不同含义:实验准备研究方案实施方法备注

    明东,司霄鹏文章:

    利用慧创近红外设备NirScan探讨针灸得气对前额叶-运动皮层网络的血流动力学反应和功能连接的调节作用的研究

    针灸,一种外部神经调节方法,可平衡交感神经和副交感神经活动并调节人脑

    研究背景:

    针灸刺激过程中,来自周围神经系统的传入神经活动首先传导到脑干,然后转移到中枢神经系统的皮层下区域,如丘脑、小脑、杏仁核。最后,人脑的高级大脑皮层,如前额叶和感觉运动网络,由皮层下区域的传入信号调节。通过在针灸刺激期间调节皮层网络,最终调节人脑的认知功能和行为结果。然而,在针灸得气的过程中,大脑的功能皮层网络是如何变化的,以及涉及哪些特定的皮层区域仍然不清楚。

    高空间分辨率功能磁共振成像研究主要揭示了针灸过程中几个皮质下脑区域的参与。例如,发现包括膝下前扣带皮层、后扣带皮层、杏仁核和海马在内的边缘-旁边缘-新皮质网络在针灸过程中失活,而岛叶、丘脑、体感和前扣带回皮层则通过针灸激活。

    由于体积传导效应和低空间分辨率,EEG未能揭示针灸过程中特定皮质区域的参与情况。综上所述,针灸得气如何调节皮质网络的关键节点和功能连接仍不清楚。

    先前的研究表明,针灸合谷穴可以调节大脑的活动,激活或抑制大脑区域以达到麻醉效果。然而,在针灸合谷穴的过程中,皮层网络是如何调节的,目前还不清楚。

    研究方法:

    为了验证我们的假设,记录了20名健康受试者的多通道fNIRS数据,包括针灸手法、操作前后的触觉控制以及针灸前后的休息控制。同时,收集各受试者的针灸得气行为表现。根据中医理论,作为调节中枢神经系统的基本针灸单位,本研究采用合谷穴来探索针灸的神经调节作用。对于具有得气反应区域的针灸,计算血液动力学反应和HbO浓度的power(HbO浓度的均方根,下文均用“能量”代指)并比较不同条件之间的区别。为探讨针灸得气反应区域血流动力学反应与行为表现之间的相关性,对皮尔逊相关性进行了分析。为了揭示针灸得气对大脑皮层网络的调节作用,计算了针灸手法和对照组大脑皮层网络的功能连通性和图论参数,并进行了比较。

    fNIRS测量:

    由多通道fNIRS系统NirScan(丹阳慧创医疗设备有限公司)完成。采样率9Hz。使用三波长(740、808和850 nm)的近红外光检测HbO和HbR的浓度信号。对于通道配置,将15个光源和16个探测器插入支架,形成48个测量通道,这些通道的定位参考标准国际10–20电极放置系统(图2B)。光源和探测器之间的距离为3厘米。

    通道定位:

    为了获得每个fNIRS通道的蒙特利尔神经学研究所(MNI)坐标、光源、探测器和锚点的空间坐标(位于 Nz、Cz、Al、Ar、Iz,指的是标准国际10-20系统电极放置)首先通过使用电磁3D数字化仪系统(FASTRAK.Polhemus VT,美国)进行测量。然后,使用空间注册方法将光源和探测器的空间坐标注册到标准MNI空间。第三,确定光源和检测器对之间中点的MNI坐标,因为每个fNIRS通道由光源和检测器对组成。第四,将中点空间投影到MNI“Colin27”脑模板的皮质表面,并将fNIRS通道的坐标定义为皮质投影点的MNI坐标。最后,为了减少测量误差,对左/右半球对称通道的坐标进行平均,并用正或负半球信息进行标记(表2)。为了揭示皮质中透射光子路径的概率,使用蒙特卡罗光子透射软件tMCimg获得皮质灵敏度。然后使用AtlasViewer在MNI“Colin27”脑模板上显示每个通道的皮层敏感性(图2B)。然后使用每个通道的皮层敏感性信息来可视化不同的指标,例如统计显著性、血红蛋白浓度和通道标记。

    划分感兴趣区域为:

    运动区、前额叶皮质(PFC)区和剩余的布罗德曼分区8

    量化针灸的得气行为效应

    本研究采用麻省总医院针灸感觉量表(MASS)作为得气指标来量化针灸感觉,为了评估不同条件下是否存在显著的得气感觉差异,分别针对触觉控制(平均两个触觉控制)与针灸操作(图2A)以及操作前触觉控制与操作后触觉控制(图3)的得气数据进行配对t检验。使用错误发现率 (FDR) 校正对p值进行校正以进行多重比较,以最大程度地减少I类错误的风险。为了验证统计结果的有效性,还使用免费软件G∗power计算了统计功效。

    预处理

    由于fNIRS记录的原始数据包含各种噪声,使用 MATLABTM17.0(MathWorks,美国)软件通过以下程序对fNIRS原始数据进行预处理,以提高信噪比(SNR)(补充图1)。首先,如果满足以下任一情况,则去除噪声信道:(I)光强度(OI)范围超过0.5–1000;(二)光源-探测器分离范围超过0-45;和(III)光强度[平均值(OI)/std(OI)]的平均值和标准偏差的比率小于2。其次,对于给定的受试者,如果受试者被排除的通道占所有通道的百分比超过50%,则信号质量差的受试者也被排除。总共有三名受试者(S14、S18、S20)被排除在后续分析之外(表1)。第三,排除噪声通道和受试者后,将光强度原始数据转换为光密度(OD)可使用分析软件实现(补充图1A)。

    为了进一步提高HbO和HbR的信噪比,进行了以下四个预处理步骤(补充图1)。在步骤1中,通过使用主成分分析(PCA)校正OD信号中包含的运动伪迹(补充图1B)。在步骤2中,去除各种生理噪音,如心脏噪音(∼1赫兹),呼吸(∼0.3 Hz)和低频漂移(<0.09 Hz)。OD数据通过0.01–0.2 Hz Butterworth带通滤波器进行过滤。使用0.1Hz 陷波滤波器去除Mayer波(~0.1 Hz)(补充图 1C)。在步骤3中,利用改进的比尔-兰伯特定律(补充图1D))以上三步均可使用分析软件实现在步骤4中,为了进一步提取功能性脑活动,使用血流动力学模态分离(HMS)算法,并获得与神经活动相关的HbO和HbR一种参考文献中提到的,软件中没有的处理方法处理方法icon-default.png?t=LA92https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28300639/

    能量计算:

    在通过预处理去除运动伪迹和系统噪声后,获得了高信噪比的HbO和HbR浓度。考虑到HbO浓度在之前的研究中被证明比 HbR更可靠和灵敏,因此使用HbO信号进行进一步分析。考虑到时域信号的均方根(RMS)幅度代表主要频率的积分幅度,HbO浓度的RMS计算为HbO能量以量化针灸过程中的皮层反应强度,步骤如下:首先,采用滑动窗口技术,移动窗口长度为5s,无重叠,将HbO划分为多个时期。其次,为了去除异常时期并提高SNR,如果HbO浓度的绝对Z分数大于3,则去除嘈杂的异常时期。最后,使用RMS方法计算每个时期的HbO能量

    血流动力学反应分析:

    为了比较不同条件之间的差异,计算了所有受试者的HbO浓度和HbO能量的平均时间序列,该时间序列也通过典型通道可视化(图4A、B、D)。为了进一步评估不同条件下是否存在显着差异,对不同条件下(针灸休息前控制、操作前触觉控制、针灸操作、操作后触觉的HbO能量数据进行单因素方差分析(ANOVA)。当ANOVA中的主要效应或相互作用显著时,进行事后t检验。为了最大限度地降低I型错误的风险,采用FDR校正对p值进行多重比较。为了验证统计结果的有效性,还使用免费软件G∗power计算了统计功效,并使用MATLABTM 17.0(美国MathWorks)软件计算上述统计分析上述方法可用软件实现

    血流动力学反应与行为表现相关性分析:

    为了揭示针灸反应区域血流动力学反应和针灸行为表现之间的关系分别对PFC和运动区所有针灸显著反应通道区域的得气行为数据和HbO能量变化进行Pearson相关和线性回归分析上述方法可用软件实现。为了验证相关结果的有效性,还使用免费软件G∗power计算了统计功效。相关分析期间不包括先前被排除的噪声通道。对于线性回归,计算并可视化多项式评估平均值的95%置信区间(补充图3)。G∗power的统计学方法

    功能连接与统计分析:

    为了研究重要针灸反应区域的信息流动,使用以下步骤进行功能连接分析。

    第1步,为了获得受试者水平的通道-通道功能连接将显著的针灸反应通道配对,以计算每个受试者的皮尔逊相关系数。整个时间序列的针灸操作和所有对照的HbO浓度分别用于功能连接分析上述方法可用软件实现在此分析中不包括先前被排除的噪声通道。

    第2步,为了进一步确定每个受试者的重要通道-通道功能连通性,使用非参数置换检验。将每个通道的HbO2浓度时间序列数据分为2s,用于每个受试者的针灸操作和所有对照。然后,使用1000 次置换重采样方法(通道对的相应时间序列随机打乱)来确定重要的功能连接(p<0.001)。

    第3步,然后对每个受试者的重要功能连接数据进行Fisher的r-to-z变换,以从正态分布中产生变体。

    第4步,为了获得组级区域到区域的功能连接性,首先通过之前的Fisher的r-to-z和z-to-r变换方法 对同一区域内成对通道的r值求平均来计算主题级别的区域到区域功能连接性数据。然后,通过平均所有受试者的区域到区域功能连接数据计算组级别区域到区域功能连接数据,最终在标准大脑模板上可视化(图6A、B和补充图4C、D)。

    第5步,为了揭示针灸操作与所有对照之间显着的组级区域间功能连接性对所有受试者的同一区域内的受试者级通道间功能连接性数据进行了配对t检验。为了验证统计结果的有效性还使用免费软件G∗power计算了统计功效。显着增加的区域到区域功能连接被可视化为一条红线(图6B)。

    第6步,为了进一步比较针灸手法和所有对照组之间不同区域对的功能连接变化(补充图5),对所有受试者不同区域内(PFC-运动皮层、PFC-PFC和运动皮层-运动皮层)的受试者水平通道间功能连接数据进行配对t检验连接性计算的方法需要学习

    网络拓扑特性分析:

    在计算每个受试者的针灸反应区域成对通道的相关系数后,获得每个受试者的相关系数矩阵可用软件上述矩阵根据计算出的相关系数矩阵,可以重建每个受试者在针灸操作和所有控制之间的功能性脑网络,其中通道作为节点,通道之间的功能性连接作为棱。在此分析过程中,未包括先前排除的噪声信道。

    为了进一步揭示针灸对功能脑网络的调节作用利用图论来描述功能网络在不同条件下的拓扑结构变图论方法需要学习。最短路径长度和全局效率被计算并用作每个主题的网络度量,其中相关系数矩阵在稀疏范围内(从0.1到0.9,步长为0.05)进行阈值化,以研究网络度量之间的关系和稀疏性(图7)。此外,还计算了其他网络指标,包括局部效率、聚类系数和小世界,如补充图6所示。

    对于具有N个节点和K个边的网络,网络的最短路径长度(图7A)定义为网络中所有节点对之间最短路径长度的平均值。

    图片

    其中 dij 是节点i和节点j之间的最短路径长度,即连接这两个节点的路径中包含的最小边数。

    全局效率(图7B)被定义为:

    图片

    其中dij是节点i和节点j之间的最短路径长度。

    为了揭示针灸操作与所有对照之间的显着差异,对所有受试者在不同条件下的全局网络度量数据进行了配对 t 检验(图7)。为了验证统计结果的有效性,还使用免费软件G∗power计算了统计功效。

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    谢组学研究产生大量的数据,这些数据具有高维、小样本、高噪声等复杂特征。如何从复杂的代谢组学数据中提取出有价值的信息,筛选出潜在的生物标志物成为近年来代谢组学研究的热点和难点。据此,本文针对目前代谢组学数据分析中的常用统计学方法及其研究进展进行介绍。

     

    代谢组学数据的特点

    代谢组学是系统生物学领域中继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,它通过检测生物体在受到外源刺激或基因修饰后其体内代谢物质的变化来探索整个生物体的代谢机制

    其研究对象为生物体内所有内源性小分子代谢物(分子量<1000Da) 。

    研究手段为高通量检测技术和数据处理方法,最终目标是数据建模和生物标志物的筛选。

    生物样品如血浆、尿液、组织等,经过GC/MS、NMR、LC/MS 等高通量仪器检测后,得到大量的图谱数据,使用XCM等软件对这些图谱数据进行转换,获得用于统计分析的标准格式的数据。

    归纳起来,代谢组学数据具有以下特点:

    • 高噪声:生物体内含有大量维持自身正常功能的内源性小分子,具有特定研究意义的生物标志物只是其中很少一部分,绝大部分代谢物和研究目的无关。

    • 高维、小样本:代谢物的数目远大于样品个数,不适合使用传统的统计学方法进行分析,多变量分析容易出现过拟合和维数灾难问题。

    • 高变异性:一是不同代谢物质的理化性质差异巨大,其浓度含量动态范围宽达7~9个数量级,二是生物个体间存在各种来源的变异,如年龄、性别都可能影响代谢产物的变化,三是仪器测量受各种因素影响,容易出现随机测量误差和系统误差,这使得识别有重要作用的生物标志物可能极其困难。

    • 相互作用关系复杂:各种代谢物质可能不仅具有简单的相加效应,而且可能具有交互作用,从而增加了识别这些具有复杂关系的生物标志物的难度。

    • 相关性和冗余性:各种代谢物并非独立存在,而是相互之间具有不同程度的相关性,同时由于碎片、加合物和同位素的存在使得数据结构存在很大的冗余性,这就需要采用合理的统计分析策略来揭示隐藏其中的复杂数据关系。

    • 分布的不规则和稀疏性: 代谢组学数据分布不规则,而且数据具有稀疏性(即有很多值为零) ,因此,传统的一些线性和参数分析方法此时可能失效。

     

    数据的预处理

    代谢组学数据分析的目的是希望从中挖掘出生物相关信息,然而,代谢组学数据的变异来源很多,不仅包括生物变异,还包括环境影响和操作性误差等方面。

    处理手段主要包括归一化(standardization) 、标准化(normalization) ,即中心化(centering) 和尺度化(scaling),以及数据转换(transformation)。

    归一化是针对样品的操作,由于生物个体间较大的代谢物浓度差异或样品采集过程中的差异(如取不同时间的尿样) ,为了消除或减轻这种不均一性,一般使用代谢物的相对浓度,即每个代谢物除以样品的总浓度,以此来校正个体差异或其他因素对代谢物绝对浓度的影响。

    标准化是对不同样品代谢物的操作,即统计学意义上的变量标准化。标准化的目的是消除不同代谢物浓度数量级的差别,但同时也可能会过分夸大低浓度组分的重要性,即低浓度代谢物的变异系数可能更大。

    数据转换是指对数据进行非线性变换,如log转换和power转换等。数据转换的目的是将一些偏态分布的数据转换成对称分布的数据,并消除异方差性的影响,以满足一些线性分析技术的要求。不同的预处理方法会对统计分析结果产生不同的影响(见表1) ,在实际应用中,我们应该根据具体的研究目的﹑数据类型以及要选用的统计分析方法综合考虑,选择适当的预处理方式。例如,Robert A. van den Berg等(2006) 通过实际代谢组学数据的分析发现,选用不同预处理方法在很大程度上影响着主成分分析(PCA) 的结果,自动尺度化(auto scaling)和全距尺度化(range scaling) 在对代谢组学数据进行探索性分析时表现更优,其PCA 分析后的结果在生物学上能够得到更合理的解释。

     

    单变量分析方法

    单变量分析方法简便﹑直观和容易理解,在代谢组学研究中通常用来快速考察各个代谢物在不同类别之间的差异。

    代谢组学数据在一般情况下难以满足参数检验的条件,使用较多的是非参数检验的方法,如Wilcoxon 秩和检验或Kruskal-Wallis 检验,t’检验也是一种比较好的统计检验方法。

    由于代谢组学数据具有高维的特点,所以在进行单变量分析时,会面临多重假设检验的问题。如果我们不对每次假设检验的检验水准α进行校正,则总体犯一类错误的概率会明显增加。

    一种解决方法是采用Bonferion校正,即用原检验水准除以假设检验的次数m作为每次假设检验新的检验水准(α/m) 。由于Bonferion校正的方法过于保守,会明显降低检验效能,所以在实际中更为流行的一种做法是使用阳性发现错误率(false discovery rate,FDR) 。

    这种方法可用于估计多重假设检验的阳性结果中,可能包含多少假阳性结果。FDR 方法不仅能够将假阳性的比例控制在规定的范围内,而且较之传统的方法在检验效能上也得到显著的提高。

    实际中也可以使用局部FDR(用fdr表示) ,其定义为某一次检验差异显著时,其结果为假阳性的概率。局部FDR 的使用,使得我们能够估计出任意变量为假阳性的概率,通常情况下有FDR≤fdr。

    除了进行传统的单变量假设检验分析,代谢组学分析中通常也计算代谢物浓度在两组间的改变倍数值(fold change) ,如计算某个代谢物浓度在两组中的均值之比,判断该代谢物在两组之间的高低表达。计算ROC 曲线下面积(AUC) 也是一种经常使用的方法。

     

    多变量分析

    代谢组学产生的是高维的数据,单变量分析不能揭示变量间复杂的相互作用关系,因此多变量统计分析在代谢组学数据分析中具有重要的作用。

    总体来说,代谢组学数据多变量统计分析方法大致可以分为两类:

    • 一类为非监督的学习方法,即在不给定样本标签的情况下对训练样本进行学习,如PCA、非线性映射(NLM) 等;

    • 另一类为有监督的学习方法,即在给定样本标签的情况下对训练样本进行学习,如偏最小二乘判别分析(PLS-DA) 、基于正交信号校正的偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) 、人工神经网络(ANN) 、支持向量机(SVM) 等。其中,PCA、PLS-DA和OPLS-DA是目前代谢组学领域中使用最为普遍的多变量统计分析方法。

     

    PCA

    PCA是从原始变量之间的相互关系入手,根据变异最大化的原则将其线性变换到几个独立的综合指标上(即主成分) ,取2~3个主成分作图,直观地描述不同组别之间的代谢模式差别和聚类结果,并通过载荷图寻找对组间分类有贡献的原始变量作为生物标志物。通常情况下,由于代谢组学数据具有高维、小样本的特性,同时有噪声变量的干扰,PCA的分类结果往往不够理想。

    尽管如此,PCA作为代谢组学数据的预分析和质量控制步骤,通常用于观察是否具有组间分类趋势和数据离群点。在组间分类趋势明显时,说明其中一定有能够分类的标志物。

    PCA还可以用于分析质控样品是否聚集在一起,如果很分散或具有一定的变化趋势,则说明检测质量存在一定的问题。Zhang Zhiyu 等(2010) 通过PCA 成功区分了骨肉瘤患者和正常人,并发现良性骨肿瘤患者中有两例是异常值。Kishore K. Pasikanti 等(2009) 利用PCA 对尿液膀胱癌代谢组学数据进行分析后观察到质控样品在PCA得分图上紧密聚集,从而验证了仪器检测的稳定性和代谢组学数据的可靠性。

    PLS-DA

    PLS-DA 是目前代谢组学数据分析中最常使用的一种分类方法,它在降维的同时结合了回归模型,并利用一定的判别阈值对回归结果进行判别分析。ZhangTao 等(2013) 运用PLS-DA技术分析尿液卵巢癌代谢组学数据,成功将卵巢癌患者和良性卵巢肿瘤患者以及子宫肌瘤患者相互鉴别,并鉴定出组氨酸、色氨酸、核苷酸等多种具有判别能力的卵巢癌生物标志物。

    PLS的思想是,通过最大化自变量数据和应变量数据集之间的协方差来构建正交得分向量(潜变量或主成分) ,从而拟合自变量数据和应变量数据之间的线性关系。

    PLS的降维方法与PCA 的不同之处在于PLS 既分解自变量矩阵也分解应变量矩阵,并在分解时利用其协方差信息,从而使降维效果较PCA 能够更高效地提取组间变异信息

    当因变量Y为二分类情况下,通常一类编码为1,另一类编码为0或-1;当因变量Y为多分类时,则需将其化为哑变量。通常,评价PLS-DA 模型拟合效果使用R2X、R2Y和Q2Y这三个指标,这些指标越接近1 表示PLS-DA 模型拟合数据效果越好。其中,R2X 和R2Y 分别表示PLSDA分类模型所能够解释X 和Y 矩阵信息的百分比,Q2Y 则为通过交叉验证计算得出,用以评价PLS-DA模型的预测能力,Q2Y 越大代表模型预测效果较好。

    实际中,PLS-DA 得分图常用来直观地展示模型的分类效果,图中两组样品分离程度越大,说明分类效果越显著。代谢组学数据分析中另一种常用的方法是OPLS-DA,它是PLS-DA 的扩展,即首先使用正交信号校正技术,将X 矩阵信息分解成与Y 相关和不相关的两类信息,然后过滤掉与分类无关的信息,相关的信息主要集中在第一个预测成分。Johan Trygg 等认为该方法可以在不降低模型预测能力的前提下,有效减少模型的复杂性和增强模型的解释能力。

    与PLSDA模型相同,可以用R2X、R2Y、Q2Y 和OPLS-DA 得分图来评价模型的分类效果。Carolyn M. Slupsky 等(2010) 使用OPLS-DA 发现卵巢癌患者、乳腺癌患者、正常人这三者之间的尿液代谢轮廓显著不同,从而推断尿液代谢组学可能为癌症的特异性诊断提供重要依据。

     

    由于代谢组学数据具有高维小样本的特性,使用有监督学习方法进行分析时很容易产生过拟合的现象

    为此,需要使用置换检验考察PLS-DA 在无差异情况下的建模效果。该方法在固定X 矩阵的前提下,随机置换Y分类标签n次,每次随机置换后建立新的PLS-DA 模型,并计算相应的R2Y 和Q2Y; 然后,与真实标签模型得到的结果进行比较,用图形直观表达是否有过拟合现象。

    由于样本量的不足,通常采用上述的交叉验证和置换检验方法作为模型验证方法。而实际中,在样本量允许的情况下,最为有效的模型验证方法即将整个数据集严格按照时间顺序划分为内部训练数据和外部测试数据两部分,利用内部训练数据建立模型,再对外部测试数据进行预测,客观地评价模型的有效性和适用性

     

    生物标志物的筛选

    代谢组学分析的最终目标是希望从中筛选出潜在的生物相关标志物,从而探索其中的生物代谢机制,因此需要借助一定的特征筛选方法进行变量筛选。

    对于高维代谢组学数据的特征筛选,研究的目的是从中找出对样本分类能力最强或较强的一个或若干个变量。特征筛选方法主要分为三类: 过滤法封装法和嵌入法

    • 过滤法主要是采用单变量筛选方法对变量进行筛选,优点是简单而快捷,能够快速的降维,如t’检验、Wilcoxon秩和检验、SAM等方法。

    • 封装法是一种多变量特征筛选策略,通常是以判别模型分类准确性作为优化函数的前向选择、后向选择和浮动搜索特征变量的算法,它通常是按照“节省原则”进行特征筛选,最终模型可能仅保留其中很少部分的重要变量,如遗传算法等。

    • 嵌入法的基本思想是将变量选择与分类模型的建立融合在一起,变量的重要性评价依靠特定分类模型的算法实现,在建立模型的同时,可以给出各变量重要性的得分值,如PLS-DA方法的VIP统计量等。

    为了更加客观、全面地评价每个变量的重要性,代谢组学研究中一般采取将上述方法结合起来的方式进行变量筛选。比较常见的一种策略是先进行单变量分析,再结合多变量模型中变量重要性评分作为筛选标准,如挑选fdr≤0.05 和VIP>1.5的变量作为潜在生物标志物。

    用筛选的潜在生物标志物对外部测试数据集进行预测,评价其预测效果。最后,可以通过研究生物标志物的生物学功能和代谢通路,分析不同生物标志物之间的相互作用和关系,从而为探索生物代谢机制提供重要线索和信息。

    Yang Jinglei 等(2013) 即在代谢组学分析中使用fdr≤0.2和VIP>1.5的双重标准来筛选精神分裂症的特异生物标志物,所筛选出的差异代谢物其AUC 在训练数据中达94. 5%,外部测试数据中达0. 895。


    参考:

    https://mp.weixin.qq.com/s/XThAKeSBriHbeYKlU96pmA

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  • PLSR)局部建模三种方法,分别建立了来自中国西藏、新疆、黑龙江、海南等13个省采集的17种土类1661个土壤样本TN值的高光谱反演模型,并对浙江省104个水稻土样本进行模型验证。结果表明,在大样本下PLSR全局模型对高TN...
  • 非靶向代谢组数据分析方法总结

    万次阅读 多人点赞 2019-04-30 18:53:10
    生物信息早已不再局限于基因组领域了,后基因组越来越受到关注,并且这几年“多组”的也研究越来越多。其中,代谢组是相对比较年轻的一门学科,“代谢组”(metabolome)的概念于1998第一次被提出。基因组...

    生物信息学早已不再局限于基因组学领域了,后基因组学越来越受到关注,并且这几年“多组学”的也研究越来越多。其中,代谢组学是相对比较年轻的一门学科,“代谢组”(metabolome)的概念于1998第一次被提出。基因组学和转录组学是生物信息的上游,更多的体现的是生物活动的内在本质因素,而代谢组学是生物信息的最下游,体现的是生物活动的表型结果。代谢组学分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学,本文将结合本人的经验和所学,综述非靶向代谢组学的数据分析方法。

    本文可结合另一篇博客(代谢组学数据分析的统计学方法综述)一起阅读,以便加深理解。

     

    概述

    什么是“代谢组学”(metabolomics)呢?

    首先,我们得明确什么叫“代谢物”(metabolite)。维基百科的定义:A metabolite is the intermediate end product of metabolism. The term metabolite is usually restricted to small molecules. 百度百科的定义:代谢物亦称中间代谢物,是指通过代谢过程产生或消耗的物质,生物大分子不包括在内。

    目前METLIN数据库中的标准代谢物分子总共超过200,000 种;一般非靶向代谢组学使用质谱仪能检测到人体血液中的代谢信号峰大约接近10,000个。由此可知,代谢组学的特征维度是比较大的。

    其次,我们了解下什么叫“代谢组”(metabolome)。维基百科的定义:The metabolome refers to the complete set of small-molecule chemicals found within a biological sample. The biological sample can be a cell, a cellular organelle, an organ, a tissue, a tissue extract, a biofluid or an entire organism. 百度百科的定义:代谢组是指生物体内源性代谢物质的动态整体。而传统的代谢概念既包括生物合成,也包括生物分解,因此理论上代谢物应包括核酸、蛋白质、脂类生物大分子以及其他小分子代谢物质。但为了有别于基因组、转录组和蛋白质组,代谢组目前只涉及相对分子质量约小于1000的小分子代谢物质。

    那么“代谢组学”(metabolomics)怎么定义呢?维基百科上说:Metabonomics is defined as "the quantitative measurement of the dynamic multiparametric metabolic response of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modification". 百度百科的解释是:代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式,是系统生物学的组成部分。注意,代谢组学还有个英文写法是“metabonomics”,这两个写法都是可以的,但其实这两个词的侧重点有些区别,此处不深究,感兴趣的童鞋可以自行查找资料了解。

    代谢组学从研究特点上可分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学无偏向地检测样本中所有能检测到的代谢物分子,是通过生信方法进行差异分析和通路分析,寻找生物标志物,初步建立模型或代谢物Panel的组学方法。而靶向代谢则是针对特定的代谢物进行检测,由于其使用标准品,因此可以实现代谢物的绝对定量(非靶向代谢组学只能相对定量)。

    用于代谢组学研究的样本,主要包括:组织、血液、尿液等,其他如生物体液、分泌物或排泄物也常用于代谢组学研究。

    数据采集的方法上来看,主要分为:核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)及液质联用(LC-MS)。NMR的灵敏度最低,LC-MS的灵敏度最高(可以检测到更多的代谢物)。采集的数据经过处理,可转化成各个代谢信号峰的相对含量值表(常使用XCMS等工具进行处理)。

    总的来说,完整的代谢组学研究,应包括实验设计、样本处理、数据采集、数据分析这几个部分,本文仅介绍非靶向代谢组学数据分析部分(注:本人接触的是血标本的LC-MS数据)。

     

    数据预处理

    采集的数据经过处理,可转化成各个信号峰的相对含量值表,这个表一般形式为:每一行代表一个信号(可由RT[保留时间]和m/z[质荷比]确定一个信号峰)在各个样本中的相对含量,也就是说,每一列代表每个样本中各个信号的性对含量(前几列除外,表示各信号的RT、m/z等信息)。每个信号可用RT值和m/z值组合进行命名。

    对于得到的这个表,我们常常进行如下3个预处理操作:信号峰注释、标准化校正、质控。

    信号峰的注释。可以对同位素峰、加合物峰进行注释,甚至可以初步鉴定部分信号峰所对应的代谢物名称。

    标准化校正。可分为批次内校正和批次间校正。需要校正是因为仪器不稳定等情况,可能使信号峰的相对含量出现误差。校正的方法有几种,目前一般首选基于QC样本的标准化方法,即:将所要采集的所有样本取等量混合起来,组成QC样本,然后在采集数据的时候,每隔一定数量的样品,插放一份QC样本。因为QC样本都是一样的,因此可以用QC样本来反映数据采集过程中信号的偏移规律。校正的工具,目前主要推荐中科院ZhuLab开源的MetNormalizer(朱正江研究员的博士生申小涛师兄开发)。

    质控。对每个信号峰的QC样本求RSD(相对标准偏差),通常需舍弃RSD超过30%的信号峰(数据质量太差)。

     

    统计分析

    单变量分析

    二分类问题的单变量分析主要分为:Wilcoxon秩和检验(或 t检验)和 Fold Change分析。多分类问题可能需要ANOVA等方法。常用的可视化方法为 Volcano Plot (火山图),可初步筛选出同时满足Wilcoxon检验统计学差异Fold Change倍数差异的信号峰。单变量分析很简单,但常常很有效。

    值得注意的一点是,单变量统计学检验,其p值的阈值设定,严格来说不应该设定为0.05,需要进行FDR校正(高维数据进行多次假设检验,容易产生大量的假阳性)。但作为初筛,许多研究往往卡得比较松。

    单变量分析中,采用中位数还是平均数来代表一个组的值呢?比如计算FC时,是用两组的中位数计算FC还是用均数去计算FC呢,以及统计学检验使用t检验还是选择wilcoxon检验呢?一般来说,如果数据分布是正态分布,则用均数,否则用中位数。

    慎用FC值(个人观点):随便使用FC值去筛选变量,很可能导致重要变量被筛出局,举个栗子:

    代谢物X在A组15个病例中的峰值分别是:92,95,95,96,96,97,98,100,101,101,101,102,102,103,103,中位数或平均数大致为100;

    代谢物X在B组15个病例中的峰值分别是:106,107,108,108,108,108,109,110,111,112,112,112,113,113,115,中位数或平均数大致为110。

    代谢物X的FC值(B/A)为1.1。若此时设定FC值以1.2作为界值,X将被排除出模型;然而X可能是一个很好的biomarker,无辜出局。

    那么,何时用FC值呢?FC值方法有个特点:FC值越接近1的变量,成为好的biomarker的概率越低。也就是说,噪音变量特别多的时候,采用FC值去排除噪音变量的效率很高。亦即信噪比很低时,FC很管用。所以在特征特别多的任务中,初筛变量的第一步会用FC爽一爽。但若建模效果不理想,有可能是初筛时排除了有效的特征,这个时候应该回过头来放宽界值甚至去除FC标准。

    P值是否也需要注意?相对来说,初筛时p值还算靠谱,宽松时可以不进行FDR校正,卡在0.05也还OK。刚刚说的FC值法,实际上触发了假阴性的情况,那么p值其实也有类似情况,当选用非参数检验时,假阴性率会上升。因此慎用非参数检验方法。同样的道理,若初筛后发现建模效果不理想,可以回过头来放宽界值甚至选择统计学检验效能更强的方法。

     

    多元统计分析

    多变量分析之前,需要对变量进行标准化(包括中心化和尺度化),尺度化的方法主要有以下两种。

    Auto scaling:自动标度化,分为两步:第一步为mean-centering中心化,第二步为UV scaling(Unit Variance scaling),也就是中心化后除以该变量的标准差。Auto scaling 也叫Z-score标准化。

    Pareto scaling柏拉图标准化,一般写成Par标准化,与UV scaling的不同之处就是对标准差开根号。

    一般用的较多的是Z-score标准化/Auto scaling。

    多元统计分析非常重要的一步是降维。提到降维,很多人的反应便是PCA、LASSO、PLS等方法。代谢组学中较多使用PLS(偏最小二乘法),因为信号峰之间的相关性较高,LASSO降维不仅会将意义较小的变量剔除,也会将相关性较高(共线性)的变量中剔除多余的。一般代谢组学需要探索代谢物之间的互作与研究结局变量的关系,因此PLS更受欢迎。当然,根据研究目的的不同(比如单纯为了找显著价值的互相独立的biomarker),也可以使用LASSO等方法降维。而PCA作为无监督的方法,在代谢组学中主要仅用于质控或寻找天然的分组。

    此处对PLS进行简略介绍(详细介绍可参考博客:偏最小二乘法 Partial Least Squares)。

    PLS作为监督学习的一种方法,不仅对自变量x成分进行了映射处理,还对结局变量y进行逐步残差拟合。除了PLS,还有其加强算法——OPLS,区分能力略微更强,可视化效果略微更好。

          

    PLS/OPLS的得分图类似于PCA的得分图,但是PLS/OPLS还可对每个变量(特征)求一个VIP值(Variable Importance in Projection),反应的是每个变量对模型解释的贡献度,VIP越大的变量越重要。

    除了VIP值,还可以求最终模型中各变量的系数(又称PLS-BETA值)和Corr.Coeffs,以及二者对应的p值

    可综合VIP值和Corr.Coeffs值筛选变量(V-Plot),或者综合PLS-BETA值和Corr.Coeffs值筛选变量(S-Plot)。

    评价(O)PLS-DA 模型拟合效果使用R2X、R2Y和Q2Y这三个指标,这些指标越接近1 表示PLS-DA 模型拟合数据效果越好。其中,R2X 和R2Y 分别表示PLSDA分类模型所能够解释X 和Y 矩阵信息的百分比,Q2Y 则为通过交叉验证计算得出,用以评价PLS-DA模型的预测能力,Q2Y 越大代表模型预测效果较好。

    PCA分析中R2X >0.4为好;PLS-DA 和 OPLS-DA分析中,R2X 这个参数不重要了,主要是R2Y 和Q2,这两个值>0.5 为好,越接近1越好。OPLS-DA中Q2(cum),是指建模后模型的预测能力,以大于0.5为宜,越接近1越好,cum 表示累积的意思。

          

    对于PLS/OPLS,我们常常需进行 permutation test(置换检验)(勿与交叉检验混淆),以确定模型是否过拟合。一般需检验模型的Q2值和R2值。对于Q2,要求置换检验结果的在y轴上的截距不超过0.05,方可认为模型没有过拟合。置换检验的基本原理:将真实分类结果(标签)屏蔽,重新随机赋予分类结果(标签),再进行建模。如果真实建模的Q2和随机标签建模的Q2接近,则说明模型过拟合。具体原理请参考其他资料。置换检验可视化的图,横坐标表示的是置换后的标签与真实标签的相关性(有多少比例的样本未打乱重新赋予标签)。

    进行降维后,除了使用PLS/OPLS多元分析方法可以继续进行多元统计建模外,还可使用SVM、RandomFores、ANN等方法进行建模。另外,最终最好使用Logistic回归建立具备临床(或生物学)解释意义的模型。

    另外,瑞典查尔默斯理工大学的施琳大神前不久发表在bioinformatics上的一篇文章,介绍了一个用于多元统计分析的方法,并开发了一个R包MUVR

     

    物质鉴定

    对于质谱仪测定的代谢物,有公共数据库可以根据m/z等信息进行鉴定,如HMDB,MassBank,METLIN等。

    有时候需要先对两批数据中取交集,这个时候可以根据m/z值和RT值进行确定,比如同时满足容差条件:m/z在5ppm内,RT在50内。之后还可根据二级谱图(MS-MS)的信息,进一步确定。

    关于ppm,举个栗子(摘自:代谢组学研究中需要了解的质谱知识丨质量精度):

    C6H12O6理论精确分子量为180.0634

    如果测得分子量为180.0631,则误差为

    180.0631-180.0634=-0.0003Da=-0.3mDa

    (180.0631-180.0634)/180.0634=1.67e-6 即 1.67ppm

     

    网络分析

    包括富集分析(Enrichment analysis)和通路分析(Pathway analysis)。通路分析中添加了通路的拓扑分析,输出通路在整体网络中的重要性(impact),重要性越大,可能意味着在整个通路中的地位越核心,那么从impact值也可以反映出来。

     

    致谢

    感谢申小涛大神、施琳大神和陈显扬大神等前辈曾给予指点!

     

    参考资料

    非靶向代谢组学数据分析总结-纲要

    History of Metabolomics

    维基百科相应词条

    百度百科相应词条

    麦特绘谱-代谢组学数据处理

    代谢组学精华汇总及该博文的参考资料

     

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  • 建立酶联免疫吸附法检测雨生红球藻粉中微囊藻毒素含量方法,并进行了方法学验证,标准曲 线为 y=-0.4004x+0.5217,R2 =0.9995,检测范围0.1ng/mL―2ng/ml,平均加样回收率为95.2%,结 果表明该方法快速、准确、可靠。...
  • 检测中发现西洋参切片存在着显著的荧光特性,通过对不同等级的西洋参及西洋参的有效成份(人参总皂苷)进行分类检测,验证西洋参所包含的荧光物质为人参总皂苷,并且所发出的荧光强度与其总皂苷含量存在对应关系,...
  • 激光诱导击穿光谱(CF-LIBS)需要元素归一化,多元素同时参与计算,土壤中微量元素谱线较弱,计算Saha-Boltzmann斜线困难,因而采用元素粒子比方法对多种国家标准土壤样品和实地采集的土壤样品中Cr的含量进行了预测。...

空空如也

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含量方法学验证