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启动子的分析和预测
2018-06-05 16:50:56启动子的分析和预测 一、摘要 加深对基因启动子的理解和认知； 学会如何获取已知基因的启动子序列数据； 熟悉不同启动子分析软件的使用及其适用范围； 学会设计启动子克隆引物。 熟悉EPD和TransFac数据库的使用...展开全文启动子的分析和预测
一、摘要
- 加深对基因启动子的理解和认知；
- 学会如何获取已知基因的启动子序列数据；
- 熟悉不同启动子分析软件的使用及其适用范围；
- 学会设计启动子克隆引物。
- 熟悉EPD和TransFac数据库的使用；
- 学会使用已知的启动子和转录因子TransFac的HMM模型，并能够独立编程，利用该HMM模型来计算鉴别未知启动子
二、材料和方法
1、硬件平台
处理器:Intel（R） Core（TM）i7-4710MQ CPU @ 2.50GHz
安装内存(RAM)：16.0GB2、系统平台
Windows 8.1、Ubuntu
3、软件平台
【1】Primer-BLAST
【2】Softberry系列工具
【3】Promoter 2.0
【4】BDGP
【5】Cister
【6】NEBcutter4、数据库资源
NCBI数据库：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
UCSC数据库：http://genome.ucsc.edu/5、研究对象
人类谷胱甘肽硫转移酶M1的promoter区域
三、结果
基因启动子序列的获取
选择基因：谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)
概况：当携带风险基因型时，对环境毒素和致癌物质的敏感性提高，易发生DNA突变和染色体畸变，患白血病的风险因而显著增加。
首先进入UCSC genome browser 查看GSTM1上游5kb范围内有无其他基因。发现该基因的上游存在同一家族的GSTM2，所以promoter大概只有3kb。
图表 1UCSC genome browser
接下来进入Genbank，搜索GSTM1，查看该基因在基因组中的定位和基因结构。
图表 2查看基因定位和结构
打开该基因的序列信息，获取该基因的启动子序列（包含exon1）
Neural Network Promoter Prediction
进入BDGP: Neural Network Promoter Prediction网站http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html，进行启动子预测
图表 3 BDGP: Neural Network Promoter Prediction网站
一共预测出来3个启动子(这个网站预测出来的promoter都是50bp)
Promoter 2.0 Prediction
使用Promoter 2.0 Prediction Server http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
进行启动子预测，也是一共预测出来3个启动子
图表 5Promoter 2.0预测结果Softberry预测
TSSW、TSSP、TSSG、FPROM都是softberry提供的启动子预测工具，进入
官网(http://www.softberry.com/)，然后点击service即可，启动子预测工具网址：
http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=promoterTSSW
TSSW具体网址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssw&group=programs&subgroup=promoter)，输入序列进行预测即可。TSSW并没有预测出来promoter区域。
图表 6TSSW预测结果TSSP
TSSP具体网址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter)，输入序列进行预测即可。共计预测出来一个promoter区域。
图表 7 TSSP预测结果TSSG
TSSG具体网址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssg&group=programs&subgroup=promoter)，输入序列进行预测即可。TSSG并没有预测出来promoter区域。
图表 8TSSG预测结果FPROM
FPROM具体网址如下(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter)，输入序列进行预测即可。FPROM并没有预测出来promoter区域。
图表 9FPROM预测结果Cister
Transcription Elements预测平台：Cis-element Cluster Finder
https://zlab.bu.edu/~mfrith/cister.shtml
由于序列只有3kb，默认参数预测出来的转录元件太少，将average distance between clusters参数由默认的3w修改为3k，最有可能的结果还是NF-1
图表 10Cister预测结果Match
转录因子预测集合网站http://gene-regulation.com/pub/programs.html (需要注册)
具体网址http://gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi
图表 11Match预测结果AliBaba 2.1
转录因子预测集合网站http://gene-regulation.com/pub/programs.html (需要注册)
具体网址http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html
预测出来一大堆，下面仅截取其中一部分。
图表 12AliBaba预测结果基因结构绘图
虽然使用了6个promoter预测在线平台，但是只有3个平台预测出promoter。
利用在线平台processon绘制基因结构图
图表 13基因结构图
接下来大致将预测结果分为4个区域，将引物设计的范围同时绘制出来（箭头为引物）PrimerBlast引物设计
图表 14引物结构
先使用默认参数进行尝试，设置好Forward primer和Reverse primer的Range，再将PCR product size最大值调成整段序列的长度3005，同时# of primers to return参数调整为1，以方便截图。
图表 15引物位置
图表 16初步设置参数
然而由于有重复序列，经过repeat filtering，不会跑出来引物，只能将参数调宽松。
图表 17默认参数结果
在Advanced parameters的Primer Parameters栏目，将Repeat filter关掉，同样可以看出来GC含量和TM值也筛选掉很多引物，在Internal hybridization oligo parameters栏目，将引物内杂交的参数调整宽松。
图表 18高级参数调整引物设计结果：
图表 19第一段
图表 20第二段
图表 21第三段
图表 22第四段
第一段：· Sequence (5’->3’) Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3’ complementarity Forward primer TCGTACCTACCCTCTGTTCGT Plus 21 164 184 60 52.38 4 0 Reverse primer GGGCTGCACTCAGTAAGACT Minus 20 2918 2899 59.39 55 5 3 第二段：
· Sequence (5’->3’) Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3’ complementarity Forward primer CCAAGTGCCCCAACTTAGCA Plus 20 849 868 60.54 55 4 0 Reverse primer GGGCTGCACTCAGTAAGACT Minus 20 2918 2899 59.39 55 5 3 第三段：
· Sequence (5’->3’) Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3’ complementarity Forward primer CCAGGCGTCACTAACACAGG Plus 20 1522 1541 60.67 60 3 1 Reverse primer GTTCCGGGAGCGAAGTCAG Minus 19 2874 2856 60.45 63.16 5 1 第四段：
· Sequence (5’->3’) Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3’ complementarity Forward primer CGAGGGCCCCTAACAGAAAA Plus 20 2405 2424 59.67 55 7 0 Reverse primer CTGGGGCTGCACTCAGTAAG Minus 20 2921 2902 60.39 60 5 3 NEBcutter酶切位点分析
使用NEBcutter分析该启动子序列，为了更加全面，查找全部的特异性位点Enzymes to use: All specificities
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
保存没有酶切位点“0 cutters”的核酸内切酶数据，见附录。
图表 23NEBcutter结果pGL4.17载体
查询pGL4.17的载体数据，获得酶切信息。查询关键词：promega pGL4.17。
图表 24pGL4.17载体信息
其中SfiI、Acc65I、KpnI、SacI、NheI、XhoI、EcoRV、BglII、HindIII这九个酶都属于在promoter内部没有酶切位点的，这些都可以选用。引物设计
从上面九个酶中随便选两个（真实情况要考虑到切割率等问题）
选择KpnI和SacI，下面是酶切位点和保护碱基对应表，KpnI选两个保护碱基。
可以看出来酶切位点序列在反向互补以后和原序列相同，直接把这段序列加在引物前面就成。
最后按照“保护碱基+酶切序列+PCR引物”的顺序，设计用于可以转到pGL4.17载体的引物。· 164…184–2918…2899 849…868–2918…2899 1522…1541–2874…2856 2405…2424–2921…2902 Forward Primer CGAGCTCTCGTACCTACCCTCTGTTCGT CGAGCTCCCAAGTGCCCCAACTTAGCA CGAGCTCCCAGGCGTCACTAACACAGG CGAGCTCCGAGGGCCCCTAACAGAAAA Reverse Primer GGGGTACCGGGCTGCACTCAGTAAGACT GGGGTACCGGGCTGCACTCAGTAAGACT GGGGTACCGTTCCGGGAGCGAAGTCAG GGGGTACCCTGGGGCTGCACTCAGTAAG 后续实验流程
接下来，用这四组引物，把四个promoter区域PCR出来，顺带PCR出来的还有保护碱基和酶切序列，导入pGL4.17，用双荧光素酶报告系统看看哪儿个promoter活性最高，大概会出来下面这种图，后面那张图明显说明promoter3活性最高。
再接下来，还可以用TFSEARCH，TFBSs，TRED这样的转录因子预测软件（上面也做了几个预测），看看活性最高的那段区域和哪儿些转录因子相关，或者用pubmed查查看文献，ENCODE，TRANSFAC等数据库，查找这个基因启动子区域的转录因子信息。接下来是编程练习部分
HMM模型
TransFac是转录因子数据库，但是好像需要注册才能下载模型的矩阵。
从EPD真核生物启动子数据库下载脊椎动物TATA-box的矩阵（共计12位碱基）。
网址http://epd.vital-it.ch/promoter_elements.php
利用该矩阵建立打分模型，对上面谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)的启动子序列进行分析，具体代码见附录。
打分值：每次取出12bp序列计算，依次计算每位碱基所占比例，再累乘得到分值（由于数值太小，分值皆除以最大分值）
图表 25打分值统计图
P值计算：使用bootstrap方法，将12bp序列打乱1000次，再按照上述方法计算分值，如果1000次内有n次分值高于“打乱之前的分值”，则p值为n/1000
图表 26 p值统计图
看的出来，整段promoter区域大部分分值都为0，p值为1。之前在线预测软件中的200,400,1200,2570这四个位置，此处也能预测出来，效果还可以。附录
”0 cutters”核酸内切酶
Col1 Col2 Col3 1 AatII GACGTC 2 AbaCIII CTATCAV 3 AbsI CCTCGAGG 4 Acc65I GGTACC 5 Acc65V GACGCA 6 AclI AACGTT 7 AfeI AGCGCT 8 AflII CTTAAG 9 AflIII ACRYGT 10 AhyRBAHI GCYYGAC 11 AjuI (N)5(N)7GAA(N)7TTGG(N)6(N)5 12 AleI CACNNNNGTG 13 AloI (N)5(N)7GAAC(N)6TCC(N)7(N)5 14 AlwFI GAAAY(N)5RTG 15 ApyPI ATCGAC(N)18NN 16 AscI GGCGCGCC 17 AseI ATTAAT 18 AsiSI GCGATCGC 19 AspDUT2V GNGCAAC 20 Asu14238IV CGTRAC 21 BaeI (N)5(N)10ACNNNNGTAYC(N)7(N)5 22 BamHI GGATCC 23 BarI (N)5(N)7GAAG(N)6TAC(N)7(N)5 24 Bce3081I TAGGAG 25 BceAI ACGGC(N)12NN 26 BcgI NN(N)10CGA(N)6TGC(N)10NN 27 BclI TGATCA 28 BdaI NN(N)10TGA(N)6TCA(N)10NN 29 BglII AGATCT 30 BlpI GCTNAGC 31 BmgBI CACGTC 32 BmtI GCTAGC 33 BpuJI CCCGT 34 BsaAI YACGTR 35 BsbI CAACAC(N)19NN 36 BsiEI CGRYCG 37 BsiWI CGTACG 38 Bsp24I (N)5(N)8GAC(N)6TGG(N)7(N)5 39 Bsp3004IV CCGCAT 40 Bsp460III CGCGCAG 41 BspDI ATCGAT 42 BsrBI CCGCTC 43 BsrGI TGTACA 44 BssHII GCGCGC 45 BstAPI GCANNNNNTGC 46 BstBI TTCGAA 47 BstEII GGTNACC 48 BstZ17I GTATAC 49 Bsu3610I GACGAG 50 BtgZI GCGATG(N)10NNNN 51 Cal14237I GGTTAG 52 CcrNAIII CGACCAG 53 Cdi11397I GCGCAG 54 Cdi81III GCMGAAG 55 CdiI CATCG 56 Cgl13032I GGCGCA 57 Cgl13032II ACGABGG 58 ClaI ATCGAT 59 Cma23826I CGGAAG 60 CstMI AAGGAG(N)18NN 61 DrdI GACNNNNNNGTC 62 EagI CGGCCG 63 EciI GGCGGA(N)9NN 64 Eco53kI GAGCTC 65 EcoRV GATATC 66 Exi27195I GCCGAC 67 FseI GGCCGGCC 68 FspAI RTGCGCAY 69 FspI TGCGCA 70 GauT27I CGCGCAGG 71 GdiII CGGCCR 72 HindIII AAGCTT 73 HpaI GTTAAC 74 Hpy99I CGWCG 75 HpyAXIV GCGTA 76 Jma19592I GTATNAC 77 Jma19592II GRGCRAC 78 Kor51II RTCGAG 79 KpnI GGTACC 80 Lmo370I AGCGCCG 81 Lsp6406VI CRAGCAC 82 Maf25II CACGCAG 83 MaqI CRTTGAC(N)19NN 84 MauBI CGCGCGCG 85 MkaDII GAGAYGT 86 MluI ACGCGT 87 MreI CGCCGGCG 88 MslI CAYNNNNRTG 89 MteI GCGCNGCGC 90 NaeI GCCGGC 91 Nbr128II ACCGAC 92 NgoMIV GCCGGC 93 NhaXI CAAGRAG 94 NheI GCTAGC 95 NotI GCGGCCGC 96 NpeUS61II GATCGAC 97 NruI TCGCGA 98 PacI TTAATTAA 99 PaeR7I CTCGAG 100 Pal408I CCRTGAG 101 PciI ACATGT 102 PcsI WCGNNNNNNNCGW 103 Pfl1108I TCGTAG 104 PflFI GACNNNGTC 105 PflMI CCANNNNNTGG 106 PlaDI CATCAG(N)19NN 107 PliMI CGCCGAC 108 PmeI GTTTAAAC 109 PmlI CACGTG 110 PpiI (N)5(N)7GAAC(N)5CTC(N)8(N)5 111 PshAI GACNNNNGTC 112 PsiI TTATAA 113 PspXI VCTCGAGB 114 PsrI (N)5(N)7GAAC(N)6TAC(N)7(N)5 115 Pst273I GATCGAG 116 PvuI CGATCG 117 RceI CATCGAC(N)18NN 118 RdeGBI CCGCAG 119 RpaB5I CGRGGAC(N)18NN 120 RpaBI CCCGCAG(N)18NN 121 RpaI GTYGGAG(N)9NN 122 RpaTI GRTGGAG 123 Rsp008IV ACGCAG 124 RspPBTS2III CTTCGAG 125 RsrII CGGWCCG 126 SacI GAGCTC 127 Saf8902III CAATNAG 128 SalI GTCGAC 129 SbfI CCTGCAGG 130 SexAI ACCWGGT 131 SfiI GGCCNNNNNGGCC 132 SgrAI CRCCGGYG 133 SgrDI CGTCGACG 134 SnaBI TACGTA 135 SpeI ACTAGT 136 SphI GCATGC 137 SpnRII TCGAG 138 SrfI GCCCGGGC 139 SsmI CTGATG 140 Ssp714II CGCAGCG 141 SstE37I CGAAGAC(N)18NN 142 Sth20745III GGACGAC 143 SwaI ATTTAAAT 144 TaqIII CACCCA(N)9NN 145 TspARh3I GRACGAC 146 TssI GAGNNNCTC 147 Tth111I GACNNNGTC 148 UbaF12I CTACNNNGTC 149 UbaF13I GAG(N)6CTGG 150 UbaF14I CCA(N)5TCG 151 UbaF9I TAC(N)5RTGT 152 UbaPI CGAACG 153 Xca85IV TACGAG 154 XhoI CTCGAG 155 ZraI GACGTC 模型矩阵
从EPD下载，保存为data.txt
http://epd.vital-it.ch/promoter_elements.phpPosition 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 17.7 19.3 6.6 83.4 0 95 72.3 94.2 53.3 29.3 17.7 22.7 C 21.1 36.1 14.8 0 0 0 0 0 0 9 32.5 33 G 29 36.4 6.8 0 0 0 0 5.8 20.1 51.2 37.7 33.2 T 32.2 8.2 71.8 16.6 100 5 27.7 0 26.6 10.5 12.1 11.1 R代码
setwd("G:/AllShare/genomicsHomework/HMMmodel") hmmmodel<- read.table("data.txt",header = TRUE) rownames(hmmmodel) <- hmmmodel$Position hmmmodel <- hmmmodel[,-1] hmmmodel <- hmmmodel/100 hmmmodel <- t(hmmmodel) library(seqinr) promoter<- read.fasta(file = "promoter.fa") seqmatrix<- as.matrix(promoter$`NC_000001.11:109684796-109687800`) # 转成大写字母 seqmatrix<- toupper(seqmatrix) maxseq<- strsplit("TGTATAAAAGGG",split = "")[[1]] # 计算打分值 computeScore <- function(seq){ score <- 1 for(i in 1:length(seq)){ score <- score*hmmmodel[i,seq[i]] } return(score) } # 使用bootstrap方法,计算p值 bootstrap<- function(seq){ flag <- 0 for(i in 1:1000){ tmp <- sample(seq) score<- computeScore(tmp) if(score>=computeScore(seq)){ flag <- flag+1 } } return(flag/1000) } maxscore<- computeScore(maxseq) bootstrap(maxseq) scorevector <- c() pvaluevector <- c() for(i in 1:(length(seqmatrix)-11)){ tmp<- seqmatrix[i:(i+11)] score <- computeScore(tmp) pvalue <- bootstrap(tmp) scorevector <- c(scorevector,score) pvaluevector <- c(pvaluevector,pvalue) } result <- data.frame(scorevector,pvaluevector) result$position <- 1:(length(promoter$`NC_000001.11:109684796-109687800`)-11) colnames(result) <- c("score","pvalue","position") result$score <- result$score/maxscore library(ggplot2) ggplot(result, aes(x=position, y=score)) + geom_line() + geom_point(size=4, shape=20) + labs(title="score by HMM model")+ theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5)) ggsave("HMM模型打分图.pdf") ggplot(result, aes(x=position, y=pvalue)) + geom_line() + geom_point(size=4, shape=20) + geom_hline(aes(yintercept = 0.05),colour="red",linetype="dashed")+ labs(title="p value by HMM model")+ scale_x_continuous(breaks = c(0,200,400,1030,1200,1632,2570,2700))+ theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5)) ggsave("HMM模型p值图.pdf")序列
Promoter序列 >NC_000001.11:109684796-109687800 Homo sapiens chromosome 1, GRCh38.p7 Primary Assembly TCTGCTCTTGAACCCTGTGTTCTGTTGTTTAAGATGTTTATCAAGACAATATGTGCACCACTGAACATAG ACCCTTATCAGGAGTTCTACTTTTGCCTTTGTCCTGTTTCCTCAGAAGCATGTGATCTTTGTTCTGCTTT TTGCCCTTTAAAGCATGTGATCTTCGTACCTACCCTCTGTTCGTACACCACCACCCCTTTTGCAATCCTT AATAAAAACTTGCTGGTTTTGAGGCTCGGGCAGGCATCATGGTCCTACCGATATGTGATGTCACCCCTGG CGGCCCAGCTGTAAAATTCTTCTCTTTGTACTCTTTCTCTTTATTTCTCAGCTGGCTGACACTTATGGAA AATAGAAAGAACCTACGTTGAAATATTGGGGGCAGGTTCCCCAATAGCCTTGCTGAGGAAATTAAATTTA TGTTCAAGTGCTATTTCTTTATGGCACCAAGGAACAAGTATTTCAAACAATACTAATGTAACAGTACTGG TTCTATGTGTTTCAAAATTATTATTCTCATGAGTGTTAGCTTTCTTAAAAAATCGTTTTTTTTTTCAATT GGATCTAGACATCTTATCTTTCACAGCTCAAGACGGATTAACTCAGAATCATAAACTCTTAATGCATAAT GAGAAATATAATGTTTCCTAGGGCCAGGCACTTGTGTCTGTGCTGGTGCTATTGCCTCAATGCAGGAAAA TCTATGTAAGAGTTCACTGTGAGGCCAAAACTGCTTCCTAAACATGGATACCTGCCAGGTATCTGAGCTG GGAGTACTGCCCAGGTCTGGATGGGCGGGGAGTGTTTGCAACAAGGACTGTGCCTTGCCAGCCTCAGTGA CACAGTGTCCAAGTGCCCCAACTTAGCAGCCACCTGCTGACCACCTGATTTCTGTGGCCTAATAGGGATG TGATGAAGTCTACCTGTTTACTCAACCCCAAACCACACATTATCCAGGTGGTTTGAAACTTTTTTGATAT ACTGGGTTCATCCTCTGGAGTCCTAACAATGTTTTAGCTAATTTACAAAAAACAAAACAAAACAAAACAA AACAAAACAAAACAAAAAAACTACTTTTTTTGCAGCACAACAGCCTGGTTTACATTGCAAAATGATTTCT CATTAAAGGTCTATCATCTATTTCCATATGTCCATTATTATTTGCAATATCCTTTAAAGCAGTCAACCCC AGGCTAATCCATTGCACAACTCTTTTGAAAGTCTTCCTTCTACCTTGAAAGAAGAAAGTTGGCAGGTTGG ACATTGTTCTCGTGGAGGTTGTACCATGGGTCACATATCACGGTGTGACTTCAAAGGCCACTGGAGCCAC CGTCTCATACTGAAGAACACACATGGGTCAGGAGCCAGGTCCAGGTCCGGAATGGTGGATCTGGAGAGGG GAGGGTCCCTGCCTGTGGTCCTGTGGGGAGCCCTCAGGCTCCTCTCTGGCCACCATCCTCTGACCTCCCT CCTCAGCAGGACAGGGTTCTGGCTTCTCTGAGGGACAGGTTCTGTGGCAGGCCAGGCGTCACTAACACAG GCCTCCATAACAACTGTTTCAGTACTGACTGAGTGGTGAAGTTAAATATTAAAAGCTGAAAAAAGCCAGT ACCTTTATACAGAGGCTGGATGTAACAAAAGCCCACCAAGAGTTTTGCTTAGGCCTTTCCTGGGCCTTAA AGCATGACAAAACAATGAAGGAATTCTTAACAGGACCTATTTAGAATTAAACAAGTTTTATTGTGAGTCT GAAGAAACTCCCCAGGCCTCCACAAACAAGTTTATTGGGCGTCTGAAGGAACTCCCCAAACCTCCGTGAT TTAGCAGGAGACAAGATAAGGGTAATCATCCCCCGCACCTGGACCCATTTAGATTAAATAAATAGACTGA GGCTCCAGAATAAGGTCCTCAGGACCCAGACCTCAGTTACAGATTAAAGAAGTTAATCACTTATGTCTTT AGATGAATGCACACTTACTTGTAGACATATACCTTAGAAGGTATATATGCTCTGGAAAACTTTGTAATAT TGAGTTGGTCTGGTGGTAATTTCTAGGCCTTCTCCCTGTTACCGGTTGCAGAAATAAAACCTCTCTTCCT CCCCATTTGATCTGCATCTCGTTATTGGGCCTAGAGAAATAGCAGCCGGACCCTCAGTTTGGTCCGGGAA GTTCTTCCATCCTCCCTCGCCTGCTCTCTGTGGCCACTGCACTCACTGTTGCTGTTGCTGTTCCGGTCTC TGTGAGGTTCACCTAGTGGACTGGCTGGACATTTCTAGGGGGCACCTCAGATACCTCACCAACTTGCTGG ATCTGATCCTTGGATTTCGATTCATAAATTGTGCCAAAATACGAAGTGGCTAATTTACACAGTACTTAGC CAGATGACCGAAGGACTCAGTACCCGAGGGCCCCTAACAGAAAACACAGACCACATTTCCTTTACTCTGG CCCTTTTCCTGGGGGTCCTTCCTATACCACTGACACTGTTCCTGTGTAGGCGGGGCTAGAGGGGAGACTA AGCCCTGGGAGTAGCTTTCGGATCAGAGGAAGTCCTGCTCTTACAGTGACAGGGGCTGAATTAAATTCCC AGGTTGGGGCCACCACTTTTTAGTCTGACCCCTGCAGCCGGAGTCTCCCAGAGCCCTTGGGAACTCGGCA GCGGAGAGAAGGCTGAGGGACACCGCGGGCAGGGAGGAGAAGGGAGAAGAGCTTTGCTCCGTTAGGATCT GGCTGGTGTCTCAAGCGCACAGCCAAGTCGCTGTGGACCTAGCAAGGGCTGGATGGACTCGTGGAGCCTC AGGGCTGGGTAGGGAAGCTGGCGAGGCCGAGCCCCGCCTTGGGCTTCTGGGCGCCCTGACTTCGCTCCCG GAACCCTCGGGCCTGGGAGGCGGGAGGAAGTCTTACTGAGTGCAGCCCCAGGCGCCCTCTCCCGGGCCTC CAGAATGGCGCCTTTCGGGTTGTGGCGGGCCGAGGGGCGGGGTCGCAGCAAGGCCCCGCCTGTCC
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汇编语言（王爽）实验十 编写子程序
2016-07-28 16:09:21在这次实验中，我们将要编写3个子程序，通过它们来认识几个常见的问题和掌握解决这些问题的方法。同前面的所有实验一样，这个实验是必须要独立完成的，在后面的课程中，将要用到这个实验中编写的3个子程序。 1．显示...展开全文标 题: 汇编实验10—— 编写子程序
作 者: XHS_12302
时 间: 2016_7_28 16:56实验10编写子程序
在这次实验中，我们将要编写3个子程序，通过它们来认识几个常见的问题和掌握解决这些问题的方法。同前面的所有实验一样，这个实验是必须要独立完成的，在后面的课程中，将要用到这个实验中编写的3个子程序。
1． 显示字符串
问题
显示字符串是现实工作中经常要用到的功能，应该编写一个通用的子程序来实现这个功能。我们应该提供灵活的调用接口，使调用者可以决定显示的位置（行、列）、内容和颜色。
提示
（1） 子程序的入口参数是屏幕上的行号和列号，注意在子程序内部要将它们转化为显存中的地址，首先要分析一下屏幕上的行列位置和显存地址的对应关系：
（2） 注意保存子程序中用到的相关寄存器：
（3） 这个子程序的内部处理和显存的结构密切相关，但是向外提供了与显存结构无关的接口。通过调用这个子程序，进行字符串的显示时可以不必了解显存的结构，为编程提供了方便。在实验中，注意体会这种设计思想。
子程序描述
名称：show_str
功能：在指定的位置，用指定的颜色，显示一个用0结束的字符串。
参数：(dh)=行号（取值范围0~24）,(dl)=列号(取值范围0~79),
(cl)=颜色，ds:si指向字符串的首地址
返回：无
就用举例：在屏幕的8行3列，用绿色显示data段中的字符串。代码：
assume cs:code data segment db 'Welcome to masm!',0 data ends code segment start: mov dh,8 mov dl,3 mov cl,2 mov ax,data mov ds,ax mov si,0 call show_str mov ax,4c00h int 21h show_str: push dx push cx push ds push si mov ax,0b800h mov es,ax mov al,160 mul dh mov bx,ax mov al,2 mul dl add bx,ax mov al,cl s: mov cl,[si] jcxz ok mov dx,[si] mov es:[bx],dx mov es:[bx+1],al inc si add bx,2 loop s ok: pop si pop ds pop cx pop dx ret code ends end start实验截图
2． 解决除法溢出的问题
问题
前面讲过，div指令可以做除法。当进行8位除法的时候，用al存储结果的商，ah存储结果的余数：进行16位除法的时候，用ax存储结果的商，dx存储结果的余数。可是，现在有一个问题，如果结果的商大于ah或ax所能存储的最大值，那么将如何？
比如，下面的程序段：
mov bh,1
mov ax,1000
div bh
进行的是8位除法，结果的商为1000，而1000在ah中放不下，
又比如，下面的程序段：
mov ax,1000h
mov dx,1
mov bx,1
div bx
进行的是16位除法，结果的商为11000H,而11000H在ax中存放不下。
我们在用div指令做除法的时候，很可能发生上面的情况：结果的商过大，超出了寄存器所能存储的范围。当CPU执行div等除法指令的时候。如果发生这样的情况，将引发CPU的一个内部错误。这个错误被称为：除法溢出。我们可以通过特殊的程序来处理这个错误， 这里我们不讨论这个错误的处理，这是后面的课程中要涉及的内容。好了，我们已经清楚了问题的所在：用div指令做除法的时候可能产生除法溢出。由于有这样的问题，在进行除法运算的时候要注意除数和被除数的值，比如1000000/10就不能用div指令来计算。那么怎么办呢？我们用下面的子程序divdw解决。
子程序描述
名称：divdw
功能：进行不会产生溢出的除法运算，被除数为dword型，除数为word型，结果为dword型。
参数：(ax)=dword型数据的低16位
(dx)=dword型数据的高16位
(cx)=除数
返回：(dx)=结果的高16位，(ax)=结果的低16位
(cx)=余数
应用举例：计算1000000/10(F4240H/0AH)
mov ax,4240h
mov v dx,000fh
mov cx,0ah
call divdw
提示
给出一个公式：
X：被除数，范围：[0,FFFF FFFF]
N：除数，范围：[0,FFFF]
H：X高16位，范围：[0,FFFF]
L：X低16位，范围：[0,FFFF]
int()：描述性运算符，取商，比如：rem(38/10)=8
rem()：描述性运算符，取答数，比如：rem(38/10)=8
公式：X/N=int(H/N)*65536+[rem(H/N)*65536+L]/N
这个公式将可能产生溢出的除法运算：X/N，转变为多个不会产生溢出的除法运算。
公式中，等号右边的所有除法运算都可以用div指令来做，肯定不会导致除法溢出。代码：
assume cs:code code segment start:mov ax,4240h mov dx,000fh mov cx,0Ah call divdw mov ax,4c00H int 21h divdw: push ax mov ax,dx mov dx,0 div cx mov bx,ax pop ax div cx mov cx,dx mov dx,bx ret code ends end start程序截图：
3.数值显示
问题
编程，将data段中的数据以十进制的形式显示出来。
data segment
dw 123,12666,1,8,3,38
data ends
这些数据在内存中都是二进制信息，标记了数值的大小。要把它们显示到屏幕上，成为我们能够读懂的信息，需要进行信息的转化。比如，数值12666，在机器中存储为二进制信息：0011000101111010B(317AH)，计算机可以理解它。而我们要在显示器上读到可以理解的数值12666，我们看到的应该是一串字符：“12666”。由于 显卡遵循的是ASCII编码，为了让我们能在显示器上看到这串字符，它在机器中应以ASCII码的形式存储为：31H、32H、36H、36H、36H（字符“0”~“9”对应的ASCII码为30H~39H）。
通过上面的分析可以看到，在概念世界中，有一个抽象的数据12666，它表示了一个数值的大小。在现实世界中它可以有多种表示形式，可以在电子机器中以高低电平（二进制）的形式存储，也可以在纸上、黑板上、屏幕上以人类的语言“12666”来书写。现在，我们面临的问题就是，要将同一抽象的数据，从一种表示形式转化为另一种表示形式。
可见，要将数据用十进制形式显示到屏幕上，要进行两步工作：
（1） 将用二进制信息存储的数据转变为十进制形式的字符串：
（2） 显示十进制形式的字符串。
第二步我们在本次实验的第一个子程序中已经实现，在这里只要调用一下show_str即可。我们来讨论第一步，因为将二进制信息转变为十进制形式的字符串也是经常要用到的功能，我们应该为它编写一个通用的子程序。
子程序描述
名称：dtoc
功能：将word型数据转变为表示十进制数的字符串，字符串以0为结尾符。
参数：(ax)=word型数据
ds:si指向字符串的首地址
返回：无
应用举例：编程，将数据12666以十进制的形式在屏幕的8行3列，用绿色显示出来。
在显示时我们调用本次实验中的第一个子程序show-str。
提示
下面我们对这个问题进行一下简单地分析。
（1） 要得到字符串“12666”，就是要得到一列表示该字符的ASCII码：31H、32H、36H、36H、36H。
十进制数码字符对应的ASCII码＝十进制数码值＋30H
要得到表示十进制数的字符串，先求十进制数每位的值。
例：对于12666，先求得每位的值：1、2、6、6、6。再将这些数分别加上30H，便得到了表示12666的ASCII码串：31H、32H、36H、36H、36H。
（2） 那么，怎样得到每位的值呢？采用如图10.2所示的方法。
图10.2除10取余法示意
可见，用10除12666，共除5次，记下每次的余数，就得到了每位的值。
（3） 综合以上分析，可得出处理过程如下：
用12666除以10，循环5次，记下每次的余数；将每次的余数分别加30H，便得到了表示十进制数的ASCII码串，如图10.3所示。
图10.3得到十进制每位数字字符的方法示意
（4） 对（3）的质疑：
在已知数据是12666的情况下，知道进行5次循环。可在实际问题中，数据的值是多少
程序员并不知道，也就是说，程序员不能事先确定循环次数。
那么，如何确定数据各位的值已经全部求出了呢？我们可以看出，只要是除到商为0，各位的值就已经全部求出。可以使用jcxz指令来实现相关的功能。代码：
assume cs:code data segment db 16 dup(0) data ends code segment start:mov ax,12666 mov bx,data mov ds,bx mov si,0 call dtoc mov dh,8 mov dl,3 mov cl,2 call show_str mov ax,4c00h int 21h dtoc: mov cx,ax ;17 jcxz bk push ax mov al,ah mov ah,0 mov bl,10 div bl mov cl,al mov ch,ah pop ax mov ah,ch div bl mov dl,ah mov dh,0 push dx mov ah,cl jmp short dtoc ;29 bk:pop ax add ax,30h mov [si],al pop ax add ax,30h mov [si+1],al pop ax add ax,30h mov [si+2],al pop ax add ax,30h mov [si+3],al ;44 pop ax add ax,30h mov [si+4],al mov byte ptr [si+5],0 ret show_str: mov si,0 mov ax,0b800h mov es,ax mov al,160 mul dh mov bx,ax mov al,2 mul dl add bx,ax mov al,cl s: mov cl,[si] jcxz ok mov dx,[si] mov es:[bx],dx mov es:[bx+1],al inc si add bx,2 loop s ok: ret code ends end start
程序运行截图至此 实验完成
题中有不足之处 希望不吝赐教
文中有的 文字是借鉴别人的 除了代码和截图
完成实验参考过别的资料，在第二个实验中受过小甲鱼视频（328/2）的启发
视频资料上云盘找：链接: http://pan.baidu.com/s/1nvpQiLz 密码: et5r
日期：2016_7_28
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【SQL】（不）相关子查询
2020-04-09 17:15:08文章目录1. 不相关子查询特点示例2.... 父），且父查询和子查询可以轻松分开单独处理 示例 题目 查询与’韩梅梅’同专业的学生信息 分析 子查询：得到’韩梅梅’的专业名 父查询：利用子查询的结果，查询同专业的学...展开全文写在前面：大家好K。首先为你点进这篇有趣的文章点赞👍！文章在撰写过程中难免有疏漏和错误，欢迎你在下方留言指出文章的不足之处；如果觉得这篇文章对你有用，也欢迎你点赞和留下你的评论。更多内容请点进👉我的博客K。👈阅览。
（不）相关查询在嵌套查询中应用，嵌套查询最能体现SQL结构化查询的特点
本篇内容，先看示例，食用更佳
1. 不相关子查询
特点
由子向父执行（子 -> 父），且父查询和子查询可以轻松分开单独处理
示例
题目
查询与’韩梅梅’同专业的学生信息
分析
子查询：得到’韩梅梅’的专业名
父查询：利用子查询的结果，查询同专业的学生信息
/* 该表结构为： * 学生信息表(学号，姓名，专业名) */ SELECT 学号, 姓名, 专业名 FROM 学生信息表 WHERE 专业 IN (SELECT 专业名 FROM 学生信息表 WHERE 姓名='韩梅梅');分步第一步：可以轻松手动分开查询，先进行子查询
/* * 第一步，查询'韩梅梅'的专业名 */ SELECT 专业名 FROM 学生信息表 WHERE 姓名='韩梅梅' /* 结果示例：得到一个集合N，里面只有一个元素'计科' |专业名| +-----+ | 计科 | */分步第二步：再利用第一步结果集合N，执行父查询的操作
/* * 第二步，查询'计科'专业的学生信息 */ SELECT 学号, 姓名, 专业名 FROM 学生信息表 WHERE 专业 IN N -- N 为第一步结果类似的，父子查询仅有查询结果直接的关系（父用子的结果），而查询条件之间无依赖，则为不相关子查询
2. 相关子查询
特点
- 父查询和子查询使用一些相同的查询条件，所以不易分开处理
- 相关子查询不能一次就求解出子查询的结果，必须反复求值
- 相关子查询事先规定了执行规则，有固定处理顺序
执行规则
（父 -> 子 -> 父）
- 外层查询条件的表中取出一个元组，传送给内层
- 执行内层查询，得到一个结果，返送给外层
- 执行外层查询，得到一个结果，作为这一次查询结果
- 执行步骤1，直到外层查询条件的表的元组全部取完
执行规则的第一步，天坑！每次查询时只取一行，随即马上传送给内层来执行！！！
外层不是一次性传整张表，否则内层条件与外层条件同为一张表，就无意义，一定体现差异！！！
不是从内层开始执行，不同于不相关子查询，第一步在外层取元组！！！
不是一次就求出结果，是反复查询，自带了循环！！！
示例
题目：查询每个学生超过他自己选修课程平均成绩的课程名
/* 该表结构为： * 课程成绩表(学号，课程名，成绩) */ SELECT 学号, 课程名 FROM 课程成绩表 x WHERE 成绩>=(SELECT AVG(成绩) FROM 课程成绩表 y WHERE y.学号=x.学号);最后一行需要别名的原因
外层：课程成绩表在循环时是一行一行的取值；
内层：需要整张表y由某一行x（x在内层查询中由相关子查询的规定已经成一个元组，而非整张表）限定，所以需要起别名区分
（表面x，y同为一张表，私底下x已变身为一行元组）
步骤
- 从
课程成绩表中取一行（x在此处含义为元组），传送给子查询 - 子查询通过
WHERE限定，得到仅含x元组对应学号的所有课程成绩信息的表☆ - 从☆表中，求得成绩的平均值，即为x元组对应学号的所有课程平均成绩O
- 将O带到外层查询（此处外层x的含义又变成整张表），得本次循环的查询结果
- 循环执行步骤1，直到课程成绩表的所有元组处理完，得到最终值
-
弹性盒子添加在父元素和子元素上的相关属性总结
2020-06-13 16:01:16弹性子元素相关属性 有排列次序 当弹性子元素少，父元素大时，有留白空间 有放大比例设置 不够的情况下缩小比例设置 单个某一个子元素的对齐方式。 下面这些都是添加在父元素上的属性 创建弹性容器 父元素上创建：...展开全文在父元素上面有 创建弹性容器 设置主轴方向 主轴方向上的对齐方式，留白空间。交叉轴的对齐方式 一根轴线上排不下时的对齐方式 以及多根轴线的对齐方式
弹性子元素相关属性 有排列次序 当弹性子元素少，父元素大时，有留白空间 有放大比例设置 不够的情况下缩小比例设置 单个某一个子元素的对齐方式。下面这些都是添加在父元素上的属性
创建弹性容器
父元素上创建：display:flex; 就是将元素设置为弹性容器。若子元素过多时，会有缩放，相当于浮动，但是区别于浮动的一点是其宽高仍然存在。
display:inline-flex; 类似于行内元素。
设置flex之后，子元素的float clear vertical 都会失效
设置主轴方向
flex-direction:row; row-reverse;
column column-reverse
主轴方向上的对齐方式
justify-content:flex-start;子元素位于弹性盒的开头
flex-end;子元素位于弹性盒的结尾，
要和主轴的反转区别：比如反转是主轴跑到了右边，从右到左为box1 box2 box3。这个是从左到右box1 box2 box3 /
center;子元素位于弹性盒中间
主轴方向上子元素的留白空间：
justify-content: space-around; / 子元素之前之后中间都有空白空间 /
justify-content: space-between; / 子元素之前之后都没有空白空间，只有子元素中间有空白空间 /
交叉轴方向上的对齐方式：
align-items: stretch; / stretch的英文翻译是拉长、撑大、有弹性 /
/ 默认值 如果子元素没有高度或者高度为自动(auto)时，将占满整个容器的高。 /
align-items: flex-start; / 子元素在交叉轴的起点对齐 /
align-items: flex-end; / 子元素在交叉轴的终点对齐 /
align-items: center; /子元素在交叉轴的中点对齐 /
align-items: baseline;/ 子元素在第一行文字的基线对齐 /
交叉轴方向上的留白空间：没有
设置弹性子元素在一根轴线上排不下时的换行方式。
flex-wrap: nowrap; / 默认值，不换行 /
flex-wrap: wrap;/ 换行 ，换行之后宽度都变的一致，即为自己设置的宽度，它不再会对自己做压缩/
flex-wrap: wrap-reverse;/ 换行，换行之后宽度一致，即为自己设置的宽度，它不再会对自己做压缩，而且第一行显示在下方 /
设置多根轴线的对齐方式：
align-content属性：设置多根轴线的对齐方式，如果只有一根轴线，属性失效。
flex-wrap: wrap;/这是换行操作，换行之后宽度都变的一致，即为自己设置的宽度，它不再会对自己的宽高做压缩/
align-content: stretch;/默认值，轴线占满整个交叉轴.这个属性曾在交叉轴垂直对齐方式出现过/
align-content: flex-start;/ 与交叉轴的起点对齐 /
align-content: flex-end;/ 与交叉轴的终点对齐 /
align-content: center; / 与交叉轴的中点对齐 /
align-content: space-around;/ 在交叉轴的之上、中间、之下都有空间
align-content: space-between; /* 只在交叉轴的轴线中间有留白 /
下面这些都是添加在子元素上的属性
order属性：调整子元素的排列次序
order:数值；数值不加单位，默认值为0，数值越大，排列越靠后
flow-grow属性：调整子元素的放大比例。
flex-grow: 0; / 0表示正常状态，不放大 /
/ 1表示一旦发生变化，弹性子元素的宽度也会做出相应的调整。
1表示把剩下的剩余空间分成三份，一个子元素都占其中的一份 /
flex-grow: 2; / nth-child(2)相当于是挑出子元素中的第二个盒子进行设置，设置为2之后，发现wrap2相当于分成了四份，box2自己占了两份。 /
flex-shrink: 0;/ 因为弹性盒子display:flex设置之后，当盒子个数过多时，小盒子会自动缩放，当拉着浏览器的右侧伸缩时，盒子会跟着伸缩，一起缩放。但是加了flex-shrink之后，盒子就不会跟着缩放了，实实在在的有多宽就是多宽，会出现水平滚动条 /
flex-shrink: 1;/ 设置为1之后就可以缩放了 /
align-self属性：调整弹性容器中被选中的子元素的对齐方式
align-self: auto;/ 默认值，继承了父容器的align-items属性，如果没有父元素，值为stretch /
align-self: stretch; / 占满整个容器的高度 /
align-self: flex-start; / 交叉轴的起点对齐 /
align-self: flex-end;/ 交叉轴的终点对齐 /
align-self: center;
align-self: baseline;/ 子元素的第一行文字的基线对齐 */需要详细的属性解释和代码解释的可以留言
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