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  • SNP/单核苷酸多态性分析

    千次阅读 2018-10-19 11:02:00
    SNP/单核苷酸多态性分析 SNP(Single Nucleotide Polymorphism),即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说,一个SNP位点只有两种等位基因,因此又叫双等位基因。SNP在人类基因组中...

    SNP/单核苷酸多态性分析

    SNP(Single Nucleotide Polymorphism),即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说,一个SNP位点只有两种等位基因,因此又叫双等位基因。SNP在人类基因组中的发生频率比较高,大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些SNP位点还会影响基因的功能,导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据,因此被广泛用于群体遗传学研究(如生物的起源、进化及迁移等方面)和疾病相关基因的研究,在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。

     

    服务项目

     
     
     
    1.TaqMan探针法
    针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时,该探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。通常用于少量SNP位点分析(见图1)。

     

    图1 某SNP位点分析结果  A.纯合(G/G)  B.杂合(G/T)

     


    2.SNaPshot法

    该技术由美国应用生物公司(ABI)开发,是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析(见图2)。

     

    图2 基因编码区9 个SNP 位点的SNaPshot 实验结果图谱

     

    3.HRM法
    高分辨率熔解曲线分析(HRM)是近几年兴起的SNP研究工具,它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况,来判断是否存在SNP,而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形,因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限,无需序列特异性探针,在PCR结束后直接运行高分辨率熔解,即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针,操作简便、快速,成本低,结果准确,并且实现了真正的闭管操作(图3)。

    图3 某基因的SNP(G>A)进行HRM分析的结果。A图为熔解曲线,B图为差异图


    4.Mass Array法
    MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具,通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDI-TOF-MS技术相结合,实现基因分型检测。基于MassARRAY平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高达40重的PCR反应和基因型检测,实验设计灵活,分型结果准确性高。根据应用需要,对数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时,MassARRAY具有最佳的性价比,特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证,或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。

    5.Illumina BeadXpress法
    采用Illumina公司的BeadXpress系统进行批量SNP位点检测,可以同时检测1-384个SNP位点,往往用于基因组芯片结果确认,适合高通量检测。微珠芯片具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、定制灵活等特点,极高的集成密度,从而获得极高的检测筛选速度,在高通量筛选时可显著降低成本。

    6.KASP基因分型技术
    KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写,可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品),对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions,插入和缺失)。

    送样要求

     
     
     
    细胞(≥106 )、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、基因组DNA(≥20μl,浓度≥50ng/μl)。

    提供结果

     
     
     
    检测SNP的原始数据、数据分析结果及书面报告。

    检测项目

     
     
     

    根据实验目的和通量的不同,阅微基因通过以下五种方式来提供SNP检测服务:

    技术优势

     
     
     
    经验丰富:国内最早应用SNaPshot方法的公司,10年经验,技术成熟,做过1000个以上案例

     

    服务全面:可以提供多种检测方法,可根据客户的样本量及位点数协助客户选择合适的实验方案

     

    结果准确:单个项目的检测结果都能保证不低于95%的检出率,如有特殊需求,可达到100%检出率

     

    技术先进:

    优化扩增体系,确保一次反应可以扩增出尽可能多的位点

    针对特殊结构位点,采用高效的DNA聚合酶,确保每个位点都有实验结果,确保客户数据的完整性

    可以针对口腔拭子、唾液等样本提取DNA

    可以提供基因分型等数据分析服务,包括HW平衡分析、聚类分析、品种鉴定、遗传图谱、关联分析、单体型分析等

    成功案例

     
     
     

    某医院客户有1000 以上样本,且只分析两个SNP位点,选用了Taqman-SNP 方法进行分型检测,散点图结果。

    Taqman-SNP 分型结果示例

    转载于:https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9815213.html

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  • 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组...

    单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。

        SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起,也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

        理论上讲,SNP既可能是二等位多态性,也可能是3个或4个等位多态性,但实际上,后两者非常少见,几乎可以忽略。因此,通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C T,在其互补链上则为G A),也可能是颠换(C A,G T,C G,A T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异,具有转换型变异的SNP约占2/3,其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高,可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点,其中大多数是甲基化的,可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

        在基因组DNA中,任何碱基均有可能发生变异,因此SNP既有可能在基因序列内,也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说,位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少,因为在外显子内,其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义,因此cSNP的研究更受关注。

        从对生物的遗传性状的影响上来看,cSNP又可分为2种:一种是同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的含义相同;另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变,从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。

        先形成的SNP在人群中常有更高的频率,后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在,其所占比率也不尽相同,但大约有85%应是共通的。

        SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究:
    1、   SNP数量多,分布广泛。据估计,人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP,人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP 遍布于整个人类基因组中,根据SNP在基因中的位置,可分为基因编码区SNPs(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周边SNPs(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因间SNPs(Intergenic SNPs,iSNPs)等三类。
    2、  SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种,但SNP一般只有两种碱基组成,所以它是一种二态的标记,即二等位基因(biallelic)。 由于SNP的二态性,非此即彼,在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析,而不用分析片段的长度,这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。
    3、  SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是:首先选择参考样本制作标准曲线,然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较,根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。
    4、  易于基因分型。SNPs 的二态性,也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容:(1)鉴别基因型所采用的化学反应,常用的技术手段包括:DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术;(2)完成这些化学反应所采用的模式,包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。(3)化学反应结束后,需要应用生物技术系统检测反应结果。
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  • 分布

    千次阅读 2020-04-01 10:38:05
    频数分布有正态分布和偏分布之分。 正态分布是指多数频数集中在中央位置,两端的频数分布大致对称。统计数据峰值与平均值相等的频率分布。 偏分布是指频数分布不对称,集中位置偏向一侧。统计数据峰值与平均值不...

    一、总体介绍:

    频数分布有正态分布和偏态分布之分。
    正态分布是指多数频数集中在中央位置,两端的频数分布大致对称。统计数据峰值与平均值相等的频率分布。
    偏态分布是指频数分布不对称,集中位置偏向一侧。统计数据峰值与平均值不相等的频率分布。
    若集中位置偏向数值小的一侧,称为正偏态分布;集中位置偏向数值大的一侧,称为负偏态分布。如果频数分布的高峰向左偏移,长尾向右侧延伸称为正偏态分布,也称右偏态分布;同样的,如果频数分布的高峰向右偏移,长尾向左延伸则成为负偏态分布,也称左偏态分布。

    峰左移,右偏,正偏

    峰右移,左偏,负偏

    性质:

    1、当总体分布呈对称状态时,中位数=平均数

    2、当总体分布呈右偏态状态时,说明存在极大值,会把平均值向极大值方向拉,中位数<平均数

    3、当总体分布呈左偏态状态时,说明存在极小值,会把平均值向极小值方向拉,中位数>平均数

    偏态分布只有满足一定的条件(如样本例数够大等)才可以看做近似正态分布。

     

    与正态分布相对而言,偏态分布有两个特点

      一是左右不对称(即所谓偏态);

      二是当样本增大时,其均数趋向正态分布。

     

    二、加深理解:

    偏态,即相对于均值左右数据的多少。
    右偏就是,数据在均值左侧的数量较多,所以为了达到所有数据于均值之差和为0,应该存在较大的数与之平衡,所有分布图里有一个很长的右端的拖尾(就是右端必须存在很大的值)
    既然均值左侧的数比较多,对比中位数左右两侧数一样多,则均值必在中位数的右侧(即这样围成面积才大于0.5)
    另外,我认为右偏的图像围成面积为0.5的分界点应该在峰值点的右侧,所以中位数大于众数。
    所以就有众小于中小于均

     

    三、全面概括:

    偏度这一指标,又称偏斜系数、偏态系数,是用来帮助判断数据序列的分布规律性的指标。在数据序列呈对称分布(正态分布)的状态下,其均值、中位数和众数重合。且在这三个数的两侧,其它所有的数据完全以对称的方式左右分布。
        如果数据序列的分布不对称,则均值、中位数和众数必定分处不同的位置。这时,若以均值为参照点,则要么位于均值左侧的数据较多,称之为右偏;要么位于均值右侧的数据较多,称之为左偏;除此无它。
        考虑到所有数据与均值之间的离差之和应为零这一约束,则当均值左侧数据较多的时候,均值的右侧必定存在数值较大的“离群”数据;同理,当均值右侧数据较多的时候,均值的左侧必定存在数值较小的“离群”数据。
        一般将偏度定义为三阶中心矩与标准差的三次幂之比。在上述定义下,偏度系数的取值无非三种情景
        1.当数据序列呈正态分布的时候,由于均值两侧的数据完全对称分布,其三阶中心矩必定为零,于是满足正态分布的数据序列的偏度系数必定等于0。
        2.当数据序列非对称分布的时候,如果均值的左侧数据较多,则其右侧的“离群”数据对三阶中心矩的计算结果影响至巨,乃至于三阶中心矩取正值。因此,当数据的分布呈右偏的时候,其偏度系数将大于0。
        3.当数据序列非对称分布的时候,如果均值的右侧数据较多,则其左侧的“离群”数据对三阶中心矩的计算结果影响至巨,乃至于三阶中心矩取负值。因此,当数据的分布呈左偏的时候,偏度系数将小于0。
        在右偏的分布中,由于大部分数据都在均值的左侧,且均值的右侧存在“离群”数据,这就使得分布曲线的右侧出现一个长长的拖尾;而在左偏的分布中,由于大部分数据都在均值的右侧,且均值的左侧存在“离群”数据,从而造成分布曲线的左侧出现一个长长的拖尾。

        可见,在偏度系数的绝对值较大的时候,最有可能的含义是“离群”数据离群的程度很高(很大或很小),亦即分布曲线某侧的拖尾很长。但“拖尾很长”与“分布曲线很偏斜”不完全等价。例如,也不能排除在数据较少的那一侧,只是多数数据的离差相对于另一侧较大,但不存在明显“离群”数据的情景。所以,为准确判断分布函数的偏斜程度,最好的办法是直接观察分布曲线的几何图形。

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  • Redis控制调用频率

    千次阅读 2017-07-06 10:43:49
    网站功能中好多地方用到了调用或访问频率的统计、限制,利用Redis可以实现访问频次的限制。 Redis官网中对incr命令的介绍中讲到了关于如何用redis来做rate limit的探讨。 官网地址为:...

    网站功能中好多地方用到了调用或访问频率的统计、限制,利用Redis可以实现访问频次的限制。
    Redis官网中对incr命令的介绍中讲到了关于如何用redis来做rate limit的探讨。
    官网地址为(英文、中文):
    https://redis.io/commands/INCR#pattern-rate-limiter
    http://www.redis.cn/commands/incr.html

    模式:Counter
    Redis的原子递增操作最常用的使用场景是计数器。
    使用思路是:每次有相关操作的时候,就向Redis服务器发送一个incr命令。
    例如这样一个场景:我们有一个web应用,我们想记录每个用户每天访问这个网站的次数。
    web应用只需要通过拼接用户id和代表当前时间的字符串作为key,每次用户访问这个页面的时候对这个key执行一下incr命令。
    这个场景可以有很多种扩展方法:
    1.通过结合使用INCR和EXPIRE命令,可以实现一个只记录用户在指定间隔时间内的访问次数的计数器
    2.客户端可以通过GETSET命令获取当前计数器的值并且重置为0
    3.通过类似于DECR或者INCRBY等原子递增/递减的命令,可以根据用户的操作来增加或者减少某些值 比如在线游戏,需要对用户的游戏分数进行实时控制,分数可能增加也可能减少。

    模式:Rate limiter
    频次限制器模式是一种特殊的计数器,它常被用来限制某个操作可以被执行的频次。这个模式的实质其实是限制对一个公共API执行访问请求的次数限制。我们使用incr命令提供该模式的两种实现。这里我们假设需要解决的问题是:对每个IP,限制对某API的调用次数最高位10次每秒。
    模式:Rate limiter 1
    对该模式一个相对简单和直接的实现,请见如下代码:

    FUNCTION LIMIT_API_CALL(ip)
    ts = CURRENT_UNIX_TIME()
    keyname = ip+":"+ts
    current = GET(keyname)
    IF current != NULL AND current > 10 THEN
        ERROR "too many requests per second"
    ELSE
        MULTI
            INCR(keyname,1)
            EXPIRE(keyname,10)
        EXEC
        PERFORM_API_CALL()
    END

    简单来说,我们对每个IP的每一秒都有一个计数器,但每个计数器都有一个额外的设置:它们都将被设置一个10秒的过期时间。这可以使得当时间已经不是当前秒时(此时该计数器也无效了),能够让redis自动移除它。
    需要注意的是,这里我们使用multi和exec命令来确保对每个API调用既执行了incr也同时能够执行expire命令。
    multi命令用于标识一个命令集被包含在一个事务块中,exec保证该事务块命令集执行的原子性。
    模式:Rate limiter 2
    另外的一种实现是采用单一的计数器,但是为了避免race condition(竞态条件),它也更复杂。我们来看几种不同的变体:

    FUNCTION LIMIT_API_CALL(ip):
    current = GET(ip)
    IF current != NULL AND current > 10 THEN
        ERROR "too many requests per second"
    ELSE
        value = INCR(ip)
        IF value == 1 THEN
            EXPIRE(value,1)
        END
        PERFORM_API_CALL()
    END

    该计数器在当前秒内第一次请求被执行时创建,但它只能存活一秒。如果在当前秒内,发送超过10次请求,那么该计数器将超过10。否则它将失效并从0开始重新计数。
    在上面的代码中,存在一个race condition。如果因为某个原因,上面的代码只执行了incr命令,却没有执行expire命令,那么这个key将会被泄漏,直到我们再次遇到相同的ip(备注,如果这里没有辅助的删除该key的措施,那么该key将永不过期,也将每次都发生错误,详情可见本人之前一篇文章)。
    这种问题也不难处理,可以将incr命令以及另外的expire命令打包到一个lua脚本里,该脚本可以用eval命令提交给redis执行(该方式只在redis版本大于等于2.6之后才能支持)。

    local current
    current = redis.call("incr",KEYS[1])
    if tonumber(current) == 1 then
        redis.call("expire",KEYS[1],1)
    end

    当然,也有另一种方式来解决这个问题而不需要动用lua脚本,但需要用redis的list数据结构来替代计数器。这种实现方式将会更复杂,并使用更高级的特性。但它有一个好处是记住调用当前API的每个客户端的IP。这种方式可能很有用也可能没用,这取决于应用需求。

    FUNCTION LIMIT_API_CALL(ip)
    current = LLEN(ip)
    IF current > 10 THEN
        ERROR "too many requests per second"
    ELSE
        IF EXISTS(ip) == FALSE
            MULTI
                RPUSH(ip,ip)
                EXPIRE(ip,1)
            EXEC
        ELSE
            RPUSHX(ip,ip)
        END
        PERFORM_API_CALL()
    END

    rpushx命令只在key存在时才会将值加入list
    仍然需要注意的是,这里也存在一个race condition(但这却不会产生太大的影响)。问题是:exists可能返回false,但在我们执行multi/exec块内的创建list的代码之前,该list可能已被其他客户端创建。然而,在这个race condition发生时,将仅仅只是丢失一个API调用,所以rate limiting仍然工作得很好。
    这里产生race condition不会有大问题的原因在于,else分支使用的rpushx,它不会导致if not than init的问题,并且expire命令将在创建list的时候以原子的形式捆绑执行。不会产生key泄漏,导致永不失效的情况产生。

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