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  • 共聚焦显微镜原理共聚焦显微镜是由显微镜光学系统、激光光源、扫描器及检测及处理系统4部分组成,采用相干性较好的激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对图象进行处理的一套...

    共聚焦显微镜也叫激光扫描共聚焦显微镜,普遍用于荧光成像和细胞分析,它成像清晰、放大倍数大、分辨率高,是生物医学领域中强有力的研究工具。

    共聚焦显微镜原理

    共聚焦显微镜是由显微镜光学系统、激光光源、扫描器及检测及处理系统4部分组成,采用相干性较好的激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对图象进行处理的一套观察、分析和输出系统。

    如下图所示,激光扫描束通过光栅针孔形成点光源,经过分光镜反射至物镜,聚焦在在标本上并进行扫描。样品受到激发后,发出的荧光回到分光镜聚集到探测针孔,Z后经过光电倍增管转化为电信号传输到计算机上显示为清晰的焦平面图像。激发光通过光栅针孔聚焦在样品上,荧光通过物镜聚焦在针孔上,此过程中形成两次聚焦,故被称为共聚焦显微镜。

    普通生物样品切片结构复杂并且有一定厚度,利用普通荧光显微镜进行观察时,样品发射的荧光相互叠加,图像分辨率大大降低。

    共聚焦显微镜的共聚焦成像能有效抑制焦平面外的杂散光和非测量光进入探测器,实现单一焦层面成像,使分辨率大为提高。载物台沿横向均匀移动时,可形成清晰的单层图像,沿纵向移动,可实现样品不同深度的逐层扫描,经过三维重建得到样品的三维立体结构,即所谓的“光学CT”。使用荧光探针对样品进行标记后再运用共聚焦显微镜观测,不仅可观察固定的各种细胞和组织结构,还可对活细胞的形态、结构、离子等进行定性定量定时观察及测定。

    共聚焦显微镜的发展历史

    1665年,diyi台光学显微镜的问世,为人类打开了微观世界的大门,成为研究生物器官、组织和细胞的重要工具,极大地推动了生命科学相关领域的发展。随着现代科学技术的飞速发展,以及医疗、生命科学、材料科学以及相关工业领域等的广泛应用需求,人们对微观事物的认知要求已不仅局限于二维图像观测,同时需要对微小物体的三维结构进行了解和研究。普通显微镜原理为物面前后一定厚度内飞所有断层图像的叠加,已无法达到应用需求。

    1951年,提出了飞点扫描显微镜的概念,打破传统光学显微镜将整幅图像同时成在系统像面上的方法,转而通过扫描激光光点与样品之间的相对运动,建立物点与像面点间的对应关系。1957年,首次阐述了扫描共聚焦显微镜技术的基本原理。

    1985年,共聚焦显微镜随着光学、视频和计算机等技术飞速发展而诞生。与以往的普通荧光显微镜相比,共聚焦显微镜具有高分辨率、高灵敏度、可三维重建和动态分析等优点,使拍摄的图像更为清晰精确和数字化,这些特征使它可以同时用于研究和分析静态及动态变化过程中的细胞结构。

    20世纪90年代,共聚焦显微镜才开始商品化,但是随着技术的不断发展和完善,该仪器的性能也得到快速的改进和提升。共聚焦显微镜广泛应用于组织学、细胞生物学、生理学和病理学等研究领域中。

    共聚焦显微镜发展趋势

    共聚焦显微镜在技术层面上为了获得更好的观察效果,着力于从提高分辨率、降低光毒性、提高扫描速度、厚样品观察、活体观察等方面提升技术水平。目前来看Z有效,对共聚焦显微镜技术推动Zda的是超高分辨率显微术,突破光学极限使研究者能够获得更精细的细胞结构,有利于研究者更深刻的认识生命活动。共聚焦显微镜技术下一步的研究重点应该集中在以下几点:

    1、更快的扫描速度

    目前共聚焦扫描速度受限于扫描设备的机械结构,要想获得更快的扫描速度只能牺牲分辨率。而很多生物过程非常迅速,目前仍然无法检测。

    2、更wan美的超高分辨率技术

    目前超高分辨率技术有STORM、PALM、STED和SSIM几种技术,分辨率从20~200nm不等,但是各种技术均有一定缺陷,例如在样品处理、Z轴方向、光毒性等方面还不近wan美,在实际观察中往往很难达到极限分辨率。

    3、更强的兼容性

    共聚焦显微镜技术涉及到多种激发方式,例如上文提到的多光子和光片式观察,相干反斯托克斯拉曼散射在理论上可以公用一套激光系统。超高分辨率显微术可以搭配白激光技术。但目前由于各公司的专利问题,在成套性和兼容性上尚有改进余地,目前的设备并无法充分发挥应用的技术优势。

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  • 激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品,它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,把光学成像的分辨率提高了...

    激光共聚焦显微镜系统的原理和应用

    激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪

    80

    年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品,它是

    在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,

    利用计算机进行图像处理,

    把光学成像的分

    辨率提高了

    30%--40%

    使用

    紫外或可见光激发荧光探针

    从而得到细胞或组织内部微细结

    构的荧光图像,

    亚细胞水平上

    观察诸如

    Ca2+

    PH

    值,膜电位等生理信号及细胞形态的

    变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究

    工具。

    激光共聚焦成像系统能够用于

    观察各种染色、

    非染色和荧光标记的组织和细胞

    等,

    察研究组织切片,

    细胞活体的生长发育特征,

    研究测定细胞内物质运输和能量转换。

    能够进

    行活体细胞中离子和

    PH

    值变化研究(

    RATIO

    ),神经递质研究,微分干涉及荧光的断层扫

    描,

    多重荧光的断层扫描及重叠,

    荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟

    扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件,

    荧光共振能量的转移的分析,

    荧光原位杂

    交研究(

    FISH

    ),细胞骨架研究,基因定位研究,原位实时

    PCR

    产物分析,荧光漂白恢复

    研究(

    FRAP

    ),胞间通讯研究,蛋白质间研究,膜电位与膜流动性等研究,完成图像分析

    和三维重建等分析。

    .

    激光共聚焦显微镜系统应用领域:

    涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药

    理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油

    地质学、矿产学。

    .

    基本原理

    传统的光学显微镜使用的是场光源,

    标本上每一点的图像都会受到邻近点的

    衍射或散射光的

    干扰

    激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成

    点光源对标本内焦平面的每一点扫

    描,

    标本上的被照射点,在

    探测针孔处成像

    ,由探测针孔后的光点倍增管(

    PMT

    )或冷电

    耦器件(

    cCCD

    )逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与

    探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,

    焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,

    焦平

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  • 更出色的表面分析ZEISS Smartproof 5产品表面粗糙度质量控制ZEISS Smartproof 5是一款集成式转盘共聚焦显微镜,依托孔径关联技术将传统共聚焦显微镜的高分辨率与转盘系统的高速采集相结合,能够高速、准确地采集表面...

    更出色的表面分析ZEISS Smartproof 5产品表面粗糙度质量控制

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    ZEISS Smartproof 5是一款集成式转盘共聚焦显微镜,依托孔径关联技术将传统共聚焦显微镜的高分辨率与转盘系统的高速采集相结合,能够高速、准确地采集表面3D数据。

    二维测量:距离、高度、角度、构造元素和基于ISO 4287标准的轮廓粗糙度

    三维测量:水平距离、3D距离、高度、角度、构造点、面积、体积和基于 ISO 25178 标准的面粗糙度

    优势:Z轴测量精度可达纳米级

    采集速度与分辨率:Smartproof 5 将点扫描系统的高分辨率与转盘系统的高速采集优势融为一体。

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    应用案例:机械加工金属表面

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    (左图)由 20x/0.7 物镜拍摄的四张真彩表面纹理叠加 3D 彩色编码高度图的拼接图片;(右图)以垂直于机械加工方向获取的粗糙度剖面图,显示了表面轮廓。 应用案例:花齿螺钉

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    应用案例:电子设备

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    (左图)叠加真彩纹理的三维视图;(中图)用 10×/0.4 物镜创建的高度图;(右图)用于测量区域粗糙度或纹理的二维高度图,例如用于质量控制或确定假冒电子设备。

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  • 激光共聚焦显微镜原理

    万次阅读 2015-12-05 09:58:46
    激光共聚焦显微镜原理 激光共聚焦扫描显微技术(Confocal laser scanning microscopy)是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本(例如细胞)进行观察时,来自观察点邻近区域的荧光会对...
    激光共聚焦显微镜原理
    激光共聚焦扫描显微技术(Confocal laser scanning microscopy)是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本(例如细胞)进行观察时,来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于,每次只对空间上的一个点(焦点)进行成像,再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中,来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰,从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。
     
    图1. 共聚焦显微镜简化原理图

    图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射,通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起,被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长,直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)(通常是光电倍增管(PMT)或是雪崩光电二极管(APD)),变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用,残余的激光则被二向色镜反射,不会被探测到。
     
    图2. 探测针孔的作用示意图
     
    图2解释了出射小孔所起到的作用:只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔;焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的,绝大部分无法通过中心的小孔。因此,焦平面上的观察目标点呈现亮色,而非观察点则作为背景呈现黑色,反差增加,图像清晰。在成像过程中,出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系(共轭conjugate),因而被称为共聚焦(con-focal)显微技术。 共聚焦显微技术是由美国科学家马文•闵斯基(Marvin Minsky)发明的;他于1957年就为该技术申请了专利。但是直到八十年代后期,由于激光研究的长足进步,才使得激光共聚焦扫描显微技术(CLSM)成为了一种成熟的技术。
     
    图3. 激光共聚焦显微镜原理框图
     
    当今的激光共聚焦显微镜已经发展为一种结合了激光技术,显微光学,自动控制和图像处理等多种尖端科研成果的高技术工具。是现代微观研究领域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信赖与创造”的一贯企业理念,正在为业界提供世界领先水平的共聚焦显微镜系统产品。
     
    图4. Nikon新一代A1激光共聚焦显微镜系统

    参考文献:

    [1] 王春梅,黄晓峰,杨家骥,陈志南,《激光扫描共聚焦显微镜技术》,第四军医大学出版社,2004年7月第一版


    注:
    二向色镜的原理是在其内放置一无色方解石(冰洲石),以将光线分解成两垂直振荡的光,而透过二向色镜分别观察这两光线的颜色。
    二向色镜右下角的那一端是要靠接观测物的,另一端靠接在眼睛;接物端有放大镜,可较清楚地观察观测物。
    二向色镜是最常用来验证双折射的仪器。
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