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    使用细胞热移位测定法鉴定嘌呤核苷磷酸化酶作为奎宁的靶标


    封面

    文献导读

    细胞热转变分析实验(CETSA)最初是为了帮助抗癌药物靶向研究而开发出来的方法,它是第一种广泛应用无标签方法来研究药物靶向完整细胞的方法。
    这项技术是根据热展开蛋白在细胞中迅速沉淀后通过监测heat challenge后剩余的可溶性蛋白来测量融化曲线的。这与使用纯化蛋白的经典热转移实验类似,配体结合通常导致蛋白稳定和熔融温度(tm)的正向转移。将CETSA与多路定量质谱连用(MS-CETSA)可以同时监测整个蛋白组在药物治疗过程中蛋白质热稳定性的变化。这样就可以在MS-CETSA中识别与药物互相作用的蛋白质,而不需要事先了解相关的通路或机制,在这项研究中,作者为用MS-CETSA来研究恶性疟原虫开发了一种有效的方法,并且将其应用于抗疟药物靶点的识别上。随后,作者用这种方法鉴定出恶性疟原虫嘌呤核苷磷酸化酶(PfPNP)为奎宁和甲氟喹的蛋白靶点。作者还运用了酶学和生物物理的体外实验,观察到了奎宁和PfPNP的高亲和力。得出了其起药物的MoAs中的作用。

    文献信息

    英文标题:Identifying purine nucleoside phosphorylase as the target of quinine using cellular thermal shift assay
    中文标题:使用细胞热移位测定法鉴定嘌呤核苷磷酸化酶作为奎宁的靶标
    作者信息:Dziekan JM, Yu H, Chen D, Dai L, Wirjanata G, Larsson A, Prabhu N, Sobota RM, Bozdech Z, Nordlund P
    通信作者:Pnordlund@ntu.edu.sg(P.N.); zbozdech@ntu.edu.sg(Z.B.)
    单位:School of Biological Science, Nanyang Technological University,637551,Singapore.
    影响因子:16.71 PMID:30602534 期刊年卷:Sci Transl Med 2019 Jan 02; 11(473)
    DOI: 10.1126/scitranslmed.ssu3174

    文献摘要

    对于临床上使用的大多数抗疟药物,我们对其机制(MoAs)一直难以捉摸。为了减少对抗疟治疗的反应性,我们有必要去更好的理解他们的作用机理(MoAs)和相关耐药性机制。在本研究中,作者采用的细胞热转变分析(CETSA)结合质谱法(MS)对人疟疾的主要致病原恶性疟原虫进行了药物靶向鉴定。验证结果是该方法对叶酸拮抗性乙胺嘧啶和广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d的有效性。随后,作者将MS-CETSA应用于两种重要的抗疟药物奎宁和甲氟喹,发现这两种药物的MoAs特征不明显。之后作者又结合了对P恶性疟原虫裂溶液和完整感染红细胞的研究,发现P恶性疟原虫嘌呤核苷磷酸化酶(PfPNP)是这两种 这两种喹啉类药物的共同结合靶点。之后作者再一次利用重组蛋白进行了生物物理和结构相关研究,证实了这两种化合物都结合在酶的活性位点上。由于奎宁与PfPNP具有较低的纳米分子亲和力;因此其治疗效果很明显。总之,作者证明了对恶性疟原虫实施MS-CETSA是阐明现有的和潜在抗疟药物的MoAs的一项有希望的方法。

    文献背景

    疟疾是由热带和亚热带地区疟原虫属原生生物引起的流行传播疾病。在过去的十年中大家通过持续不断的努力去根除疟疾使得全球负担和死亡率大大的减少了。然而, 疟疾仍然是一个重大的健康问题,根据世界卫生组织的估计,仅在2016年便有2.16亿疟疾患者和44500例死亡患者。最近在疟疾控制方面取得的成功主要是有效的控制了媒介和采用了青蒿素联合疗法。然而,蚊子对常用杀虫剂的耐药性的增加和疟原虫对标准ACTs的反应性降低可能会使疟疾发病率在不久的将来大幅度的升高。
    绝大多数用于临床上的抗疟药物并没有合理设计来干扰特定的分子靶点,而是根据它们在表型筛选中的强大抗疟特性进行鉴定的。因此对其作用机制(MoAs)的了解在大多数情况下仍处于初级阶段。在所有现有的抗疟药物中,除了青蒿素之外,喹诺宁是临床中使用最广的一类药物奎宁,甲氟喹以及氯喹直到今天还被广泛地运用于临床。尽管氯喹的抗疟作用似乎与抑制寄生虫消化液泡中的红素解毒密切相关,但是其他喹啉类药物的作用机制仍然不清楚。
    现今,甲氟喹是ACT配方中的关键的药物,特别是在东南亚使用的甲氟喹仍然是疟疾的重要化学预防剂。上个世纪80年代,东南亚报道了两种药物的耐药性,并且其耐药性与pfmdr1基因复制的增加有关。pfdr1编码一种跨膜转运蛋白pfpGH1, 该转运蛋白被认为有介导药物从细胞质流入到消化液泡作用。这表明甲氟喹/奎宁的分子靶点存在于细胞溶胶中,因此两种药物的MOSA(至少一部分)与氯喹不同。与此一致的是,最近的研究表明,甲氟喹通过与80S核糖体结合来抑制转录,但是到目前为止还没有发现奎宁的具体靶点。

    结果分析

    CETSA对恶性疟原虫的适应性
    在这项研究中,作者实施并验证了用MS-CETSA来鉴定恶性疟原虫蛋白质组中抗疟药物的直接蛋白质靶标。作者使用体外血液阶段恶性疟原虫寄生虫的细胞裂解物来研究直接药物-靶标相互作用(“裂解物”)。此外,作者还使用了完整的恶性疟原虫感染的红细胞来研究药物-靶标参与和随后的细胞环境中的下游效应(“完整细胞”)。由于红细胞(RBC)细胞质中高丰度的血红蛋白和碳酸酐酶-1,他们会影响MS分析,所以对于细胞内环境,作者使用了恶性疟原虫感染的磁性富集红细胞来进行实验。总的来说,作者采用了两种现有的CETSA数据收集策略变体(图1)(i)熔解曲线CETSA方法,其中在存在或不存在药物的情况下在10个不同温度下监测蛋白质沉淀; (ii)等温剂量反应(ITDR)CETSA,即在单一温度下用多种药物浓度监测蛋白质稳定化。裂解物和细胞内CETSA数据集的交叉参考提供了辨别直接和间接药物作用的途径之一。
    为了首先评估恶性疟原虫蛋白质组在滋养体阶段的融化特性,作者对未经处理的裂解物和完整细胞样品进行熔解曲线CETSA分析,确定蛋白质组范围内蛋白质在37°C至73°C温度范围内的热稳定性(图2A)。因此,作者计算了每个数据集中单个蛋白质熔解温度(Tm;相当于50%蛋白质变性)的分布(图2B)。得出的结果是从裂解物实验中分离的蛋白质表现出明显更高的整体热稳定性。特别地,在裂解物中存在显著更高比例的热稳定蛋白(44%)。因此,为了进一步分析,作者采用了更严格的标准在进行实验研究。作为这些严格标准的结果显示,完整细胞中的平均蛋白稳定性略低(ΔTm= 0.3°C)。这与对人类永生化髓性白血病(K562)细胞进行的类似比较一致。作者还观察到两种熔解曲线实验变体中的许多大蛋白复合物的相关沉淀(图S1),这与最近在人类细胞中描述的热邻近共凝集的概念一致(26)。在这里,作者发现RBC蛋白中的全局Tm分布通常高于恶性疟原虫或K562细胞蛋白质组(图S2)。在这里插入图片描述

    基于CETSA的方法用于鉴定恶性疟原虫中的蛋白质药物靶标

    为了鉴定恶性疟原虫中的药物 - 靶标相互作用,作者采用了CETSA方案的ITDR变体,使用从熔解曲线实验获得的信息(图2)。相对于非变性条件,ITDR中的靶蛋白参与被认为是响应于在单一温度下药物浓度增加的蛋白质稳定化(参见图1和材料和方法)。使用mineCETSA(一种内部开发的R包)进行数据分析,缩放和药物 - 靶标相互作用的鉴定(参见材料和方法)。
    在缺乏关于药物的假定靶标的身份的先验知识的情况下,作者选择ITDR分析的热挑战温度,使得全局蛋白质组被充分取样。因此,对于随后的ITDR分析,作者选择对应于恶性疟原虫蛋白质组的平均Tm的51℃和57℃以解释在完整细胞样品中观察到的蛋白质组的更热稳定部分(图2B)。为了验证完整细胞CETSA中的这种策略,作者研究了E64d的蛋白质靶标参与,E64d是一种广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂,已知与恶性疟原虫蛋白质组中的几种靶标相互作用。得出的结果表明CETSA具有以高度特异性检测疟疾寄生虫蛋白质组中直接药物 - 靶标结合的能力。
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    基于CESTA的恶性疟原虫甲氟喹和奎宁分子靶标的鉴定
    接下来,作者进行了ITDR分析,以确定奎宁和甲氟喹的蛋白质靶标。对暴露于奎宁(0至10μM)或甲氟喹(0至100μM)的裂解物样品应用ITDR(51°C)方案,作者发现嘌呤核苷磷酸化酶(PfPNP; PF3D7_0513300)是唯一表现出高可信度稳定性的蛋白质。在两个数据集中同时检测到2157和2032个恶性疟原虫蛋白质(图4,A至D)。在用甲氟喹进行的两个相应的完整细胞ITDR中未观察到PfPNP的稳定化,这揭示了三种其他蛋白质的剂量依赖性稳定化。丙酮酸激酶II(PfPyKII; PF3D7_1037100)在完整细胞ITDR(57℃)中表现出早期剂量依赖性稳定化(MDT,~19.5nM)。然而,这伴随着37℃下蛋白质丰度的增加,表明稳定化可能反映了药物结合的下游效应,也导致蛋白质水平增加。考虑到PfPyKII对于寄生虫的代谢至关重要,参考条件下蛋白质丰度的变化可能代表对药物引起的扰动的一般应激反应。在完整细胞ITDR(57℃)中也观察到两种线粒体蛋白热休克蛋白70(Hsp70-3; PF3D7_1134000)和GrpE蛋白同源物(Mge1; PF3D7_1124700)的稳定化,但仅在最高药物剂量下可检测到(10μM)(图S4)。这可能反映了由恶性疟原虫细胞中甲氟喹诱导的反应性氧化物种(ROS)对线粒体膜的间接影响。尽管甲氟喹具有更广谱的恶性疟原虫蛋白(包括PfPNP),但在MS-CETSA中,奎宁似乎几乎完全参与PfPNP。使用Western印迹进一步验证,直接再现观察到的PfPNP稳定性的变化(图S5)。因此可以想象,PfPNP不仅在奎宁的MoA中起主要作用,而且还可以促成甲氟喹的MoA。我们还在完整细胞ITDR实验中观察到响应奎宁(MDT,0.15μM)的人线粒体60-kDa热休克蛋白(HSPD1; P10809)的稳定化(图S6)。目前,关于宿主蛋白在寄生虫生长和/或其在药物MoAs中的作用的作用知之甚少。尽管如此,这些结果可能表明它们的生物学相关性。
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    奎宁和甲氟喹与PfPNP结合的体外验证
    为了进一步评估PfPNP与奎宁和甲氟喹的相互作用,作者使用异源表达的重组PfPNP在体外研究了结合特性。首先,我们使用差示扫描荧光测定法(DSF)监测奎宁和甲氟喹对PfPNP的相对稳定作用(图5A)。总体而言,DSF证明ImmH,奎宁,甲氟喹和奎尼丁具有剂量依赖性稳定作用。为了补充DSF分析,我们使用表面等离子体共振(SPR)研究了奎宁和甲氟喹与重组PfPNP的亲和力和结合动力学(图5,B和C)。使用单轮和多轮稳态或动力学拟合实验测量三种化合物的结合和解离速率(表S2)。如所预期的,ImmH显示出对PfPNP的紧密结合和非常慢的解离速率,平衡常数(KD)为约250pM。喹啉对PfPNP的亲和力较低。最后,作者通过等温滴定量热法(ITC)验证了观察到的PfPNP与奎宁和甲氟喹的结合。 ITC结果也与SPR结果非常一致,显示出对奎宁(KD = 65 nM)和甲氟喹(KD =11μM)的相似结合亲和力(图S7和表S3)。
    接下来,作者使用体外酶测定法,监测PfPNP催化的肌苷向次黄嘌呤的转化,以研究奎宁和甲氟喹对PfPNP的抑制作用。两种药物均阻断PfPNP酶活性。然而,这些值与SPR和ITC的亲和力相关,表明奎宁和甲氟喹都与PfPNP相互作用,尽管亲和力低于ImmH。在两种抗疟疾化合物中,奎宁对PfPNP具有始终较高的亲和力并且增加了抑制活性,这也反映在最初的ITDR CETSA测量中。因此,PfPNP的抑制可能与奎宁的MoA相关,而PfPNP与甲氟喹相互作用的临床相关性可能不太相关。为了检验这种可能性,作者在体外培养的恶性疟原虫中评估了两种药物与ImmH组合的抗疟活性。作者使用等效线图分析,用于揭示药物对之间的协同和/或拮抗作用。在组装的等效线图中,与ImmH组合时,两种喹啉均诱导了较低的杀灭效果(奎宁,ΣFIC50≤1.43;甲氟喹,ΣFIC50≤1.70)。在所测试的药物比例中可以观察到两种异构体的显着偏差,这表明药物拮抗作用。相比之下,ImmH与E64d组合的等效线图预计不会与PfPNP相互作用,显示出与线性函数的偏差幅度明显较低(平均值ΣFIC50= 1.09),表明加性独立活动。因为PfPNP是ImmH和两种喹啉药物中唯一已知的共同靶标,所以观察到的拮抗作用可能是由于与PfPNP活性位点结合的竞争引起的。
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    甲氟喹和奎宁的晶体结构与PfPNP结合

    为了进一步阐明PfPNP的抑制模式,作者分别用1.66和2.30Å的分辨率确定了蛋白质与奎宁和甲氟喹的共晶结构。结构显示两种化合物都结合在PfPNP的活性位点袋中(图6,A和B),这与它们对酶活性的有效抑制一致。在共结晶的PfPNP-奎宁和PfPNP-甲氟喹配合物中观察到的PfPNP折叠高度相似,这表明两种结构之间原子定位的低度可变性[即,Cα原子的均方根偏差(RMSD)为0.2一个]。整体结构也与先前测定的PfPNP-肌苷(RMSD,0.34 /0.41)和PfPNP-ImmH·SO 4(RMSD,0.24 /0.28)的复合物非常相似(图S8)。
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    讨论回顾

    疟原虫寄生虫的特征在于结合了动物和植物样特征的独特生物学,因此与其他真核系统相比仍然知之甚少。因此,为研究其他真核系统中的药物活动而开发的研究工具已被用于研究这些原生动物,但效果有限。因此,即使对于临床使用已有数十年的化合物,我们对绝大多数抗疟药物的MoAs的理解仍然不完整。在这里,作者探索了CETSA方法,用于直接在恶性疟原虫细胞中鉴定抗疟疾化合物的蛋白质靶标。
    奎宁和甲氟喹似乎具有重叠的MoAs,两种药物的MoAs似乎同时涉及几种生物过程的破坏,但对于奎宁,先前未发现直接的蛋白质靶标。相反,最近提出了甲氟喹与80S核糖体的直接相互作用,导致寄生虫蛋白质合成的减弱。在这里,作者显示奎宁和甲氟喹与疟原虫细胞中的PfPNP相互作用,并且两种药物都具有抑制PfPNP酶活性的能力。虽然奎宁和甲氟喹在最初的基于裂解物的CETSA中表现出与PfPNP相当的热稳定性(奎宁的MDT–0.1μM和甲氟喹的约0.6μM),但在后续研究中,奎宁表现出高达三个数量级的亲和力。对这种酶,奎宁能够以结合常数Ki~140nM抑制PfPNP酶活性,这表明其作为临床相关活性的潜力。
    在奎宁和甲氟喹与ImmH的细胞毒性作用之间观察到的拮抗相互作用支持了PfPNP抑制有助于其抗疟活性的观点。然而,虽然immucillins通过同时抑制宿主和寄生虫PNP酶发挥其抗疟作用,但我们没有发现奎宁和甲氟喹与人PNP相互作用的证据。
    鉴于新出现的青蒿素抗性,对疟疾的新疗法的需求变得尤为迫切。通过公共和私营部门的共同努力进行的高通量表型筛选测试了数百万种化合物,这些化合物对恶性疟原虫的不同发育阶段产生了数万个活性<1μM的分子。剩下的主要挑战之一是确定最有效化合物的内在分子靶标,同时优先考虑新的化学型。过去几年为恶性疟原虫开发的新技术提高了我们识别和验证候选药物目标的能力。然而,MS-CETSA与用于药物靶标识别的现有工具相比具有几个优点。其在大部分寄生虫蛋白质组中监测与蛋白质靶标的直接生物物理结合的能力同时使其适合于鉴定具有先前未确定的作用模式的化合物的药物靶标。CETSA的无标记原则允许其与选择的寄生虫菌株和标准未修饰化合物一起使用,从而减少合成特殊药物探针所需的时间和成本。我们相信,恶性疟原虫MS-CETSA的开发可以补充现有工具,促进抗疟药物靶点发现工作,并有助于进一步加深我们对寄生虫生物学的理解。

    参考文献

    [1]点击查看原文献
    [2]点击查看文献补充图
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    Lonza PyroGeneTM重组C因子试剂盒是内毒素检测方法的发展成果。通过体外重组鲎凝血级联反应的第一个组分:C因子,重组C因子法只需一部反应,优于传统LAL法且不依赖动物源成分-鲎血。

     

    PyroGeneTM重组C因子法,激活的C因子直接剪切一个荧光底物,产生的信号被荧光酶标仪识别。由于荧光信号的动态范围大,相较于传统的动态LAL法,PyroGeneTM重组C因子法只需一步反应,检测范围即可达到5.0EU/ml – 0.005 EU/ml。

     

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    ▲ 上图分别展示了PyroGeneTM重组C因子与传统LAL法,如动态显色法和动态浊度法的激酶级联反应。

     

    与经典的鲎试剂内毒素检查方法相比,重组C因子内毒素检测法具有更高的特异性,更好的专属性、精密度、准确度、线性范围及定量限,是目前鲎试剂内毒素检测方法的改良方法,具有以下优点:

     

    • 内毒素特异性,重组技术消除了鲎试剂中β-1,3-葡聚糖对检测结果的干扰,导致潜在假阳性的产生

    • 不依赖动物源性成分,提供更高的供应安全性

    • 重组表达生产,产品批间一致性良好

    • 终点荧光测定,与其他定量鲎试剂方法相当

    • 灵敏度范围从0.005到5EU/ml

    • 消除了对动物源试剂的依赖,符合3R的替代原则

    • 药典推荐

    可替代传统鲎试剂用于人用和动物用注射药物(如化学药品、放射性药物、抗生素类、生物制品等)及医疗器械(如透析液、植入式器械等)的原辅材料、中间产品、放行产品的内毒素检测。

     

     

    重组C因子法合规审批历史

    • 2012年6月,美国食品药品管理局(FDA)发布了“工业热原与内毒素检测的问答指南”文件,将重组C因子法作为LAL法的替代内毒素检测方法*。

     

    • 2015年7月,欧洲药典在新起草的章节5.1.10中将重组C因子法作为LAL和家兔热源测试的替代内毒素检测方法*。

     

    • 2016年7月1日,章节5.1.10正式生效。美国食品药品管理局(FDA)已经允许了510(K)使用PyroGeneTM重组C因子法进行内毒素放行检测的药物临床申请。

     

    • 2018年9月,美国食品药品管理局(FDA)首次批准使用重组C因子法进行细菌内毒素放行检测的药物,一款用于治疗成人偏头痛的单抗药物。

     

    • 2018年12月,欧洲药典起草了重组C因子法细菌内毒素检测的新章节2.6.32。

     

    • 2019年1月,继欧洲药典(EP)、日本药典(JP)和美国药典(USP)之后,第4版本的中国药典将重组C因子法列为细菌内毒素检测方法,并将在2020年生效。

    * 参见美国药典(USP)

     

     

    Lonza rFC 产品

    图片

    关于Lonza

    LONZA(龙沙)集团是一家以生命科学为主导,总部位于瑞士,旗下20多家生产厂和研发中心遍布全球各地。龙沙是世界医药、保健及生命科学领域的领先供应商之一,其产品和服务满足客户从研发到终端产品制造的需求。截至2019年底,龙沙在全球拥有100多个生产基地和办事处以及约15,500名全职员工。2019 年,公司销售额达59亿瑞士法郎,核心业务的息税折旧摊销前利润(EBITDA)达16亿瑞士法郎。

     

    关于Lonza内毒素检测试剂盒

    关于推荐仪器:PyroWaveXM、SynergyHTX

    试剂:

    所有试剂,包括荧光溶质和检测用缓冲液,均必须无内毒素。必要时,根据测试盒生产商的指示要求溶解试剂。试剂应根据生产商要求冷藏或冷冻条件下存贮。

    BET用水(细菌内毒素检测用水):

    注射用水R或采用其它方法生产的水,在试剂检测限水平不会与试剂发生反应。

    标准内毒素贮备液制备:

    标准内毒素贮备液采用经过国际标准如内毒素标准BRP标定的内毒素标准品制备,内毒素单位为国际单位(IU),国际标准的IU等同性由WHO规定。遵照包装说明书和标签上的要求制备和存贮标准内毒素贮备液。

    标准内毒素溶液制备:

    剧烈混合标准内毒素贮备液,使用BET用水制备适当级别稀释液,溶液应尽快使用以避免活性因吸收而降低。

    供试液制备:

    用BET用水溶解或稀释原料药或制剂制备供试液。有些原料药和制剂可能需要溶解或解释在其它水性溶液中。必要时,调节供试液pH值(或稀释)使得试剂与供试液混合物的pH值在测试盒生产商所指定的pH范围内,通常为6.0-8.0。可根据测试盒生产商的建议使用酸碱或适当的缓冲液调整pH。酸碱可采用浓缩物或固体经BET用水在没有可检出内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证无可检出内毒素和干扰因子。

    最大有效稀释度确定:

    按照试剂盒或药典描述的方法进行确定。

    荧光定量检测:

    本实验是基于内毒素浓度和试剂混合物在孵育结束后的荧光之间的定量关系,表示为ΔRFU。

     

     

    ΔRFU= RFUtend-point- RFUt0

    RFUt0:孵育开始时试剂混合物荧光,对于所有的待测样品来讲,RFUt0应该是非常接近的,表明所有待测样品本底信号是均匀一致的,没有其他因素的干扰。

    RFUtend-point:孵育结束时试剂混合物荧光

    在检测盒生产商所建议的孵育温度进行检测(通常为37 ±0.5°C)。

    预检测:

    预检测是为了确保荧光技术有效性。此检测是为了证明满足标准典线的标准,并且供试液对检测无干扰。

    标准曲线标准:

    仪器灵敏度必须根据每批rFC或标准内毒素进行调整,其设置必须符合测试盒生产商的建议。使用标准内毒素溶液,在试剂盒生产商指定的浓度范围内制备至少3个内毒素浓度溶液,制作标准曲线。如果所需范围超出生产商所指定浓度范围的2个以10为底的浓度对数,则必须包括更多标准以覆盖范围内每个浓度对数增加值。按生产商建议(体积比、培养时长、温度、pH等),每个标准内毒素溶液至少配制3份重复检测。

    在所制备的内毒素浓度范围内,相关系数绝对值|r|必须大于等于0.980。

    干扰因子:

    由于rFC试剂盒没有因子G,因此无法激活假阳性β-葡聚糖。在将本方法与其它细菌内毒素定量方法进行比较时必须考虑此情况。

    选择等于或接近于内毒素标准曲线中间值的内毒素浓度。按下表要求配制溶液A、B、C和D。按检测合生产商要求每个溶液至少检测2次(供试液和测试试剂盒混合物体积,供试液与测试试剂盒混合物的体积比,培养时间等)。

     

     

    溶液A=供试液,可稀释但不得超过MVD

    溶液B=与溶液A相同稀释倍数配制后检测,添加了等于或接受标准曲线中间浓度内毒素

    溶液C(阳性控制)=标准内毒素溶液

    如果满足以下要求,则认为检验有效

    • 溶液C制作的标准曲线的相关系数r绝对值大于等于0.980
    • 溶液D所得结果不得超过所用试剂混合物描述所要求的空白限值,或低于所用rFC的内毒限检测限。
    • 从添加了内毒素的溶液中(溶液B,上表)扣除溶液中平均内毒素浓度(如有)(溶液A,上表)计算平均回收率。
    • 如果在检测条件下,供试液中添加内毒素后检出浓度扣除未添加前溶液中检出的内毒素后,为已知添加浓度的50-200%,则认为供试液没有干扰因子。

    如果内毒素回收率超出指定范围,则认为供试液含有干扰因子。使用不超过MVD的更大稀释倍数重复检测。另外,供试液或稀释后供试液(未超过MVD)的干扰有可能通过执行适当的经验证的处理方法消除,例如,过滤、中和、渗析、热处理或内毒素专用绑定步骤(在没有干扰基底时,检测之前从供试液中富集内毒素)。为证明所选处理方法可有效消除干扰而不损失内毒素,应使用待检样品添加标准内毒素和进行所选处理的样品重复干扰因子测试。

    检测程序

    检测程序和预检测步骤基本是一样的,把需要的检测样品作为供试品即可。Lonza和Hyglos都有特别编写的程序,完成供试品在板上的分布后,直接运行即可。仪器会自动完成检测并给出检测分析结果。

    RFUt0、RFUtend-point检测结果示意图

     

     

    所有供试品及标准品的RFUt0的初始值都在同一水平上。

     

     

    以logΔRFU和log标准品的浓度值做线性拟合,得到下图标准曲线

     

     

    标准曲线的回归系数,r2应大于0.9604,即r绝对值大于0.980,才能判定标准曲线有效。

    系统会自动判断是否符合预设的条件,给出有效或无效的结论。

    如果空白对照(BLK)的平均内毒素浓度低于标准品的最低内毒素限值,则认为符合要求。

     

    至此,rFC检测基本完成,每个公司可以根据自己公司的要求,编辑自己特殊要求的检测报告,审计追踪,电子签名,QC趋势图等等,就不再一一赘述。

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  • 德尔菲——意见可靠预测方法

    千次阅读 2019-07-09 08:59:14
    德尔菲/得尔飞(Delphi Method) 目录 1德尔菲的简介 1.1德尔菲的起源演变 1.2德尔菲的典型特征 2德尔菲的特征 3德尔菲的具体实施步骤 3....

    原文地址:https://wiki.mbalib.com/wiki/%E7%89%B9%E5%B0%94%E8%8F%B2%E6%B3%95

    德尔菲法/得尔飞法(Delphi Method)

    目录

    德尔菲法的简介

      德尔菲法是在20世纪40年代由O.赫尔姆和N.达尔克首创,经过T.J.戈尔登和兰德公司进一步发展而成的。德尔菲这一名称起源于古希腊有关太阳神阿波罗的神话。传说中阿波罗具有预见未来的能力。因此,这种预测方法被命名为德尔菲法。1946年,兰德公司首次用这种方法用来进行预测,后来该方法被迅速广泛采用。

      德尔菲法也称专家调查法,是一种采用通讯方式分别将所需解决的问题单独发送到各个专家手中,征询意见,然后回收汇总全部专家的意见,并整理出综合意见。随后将该综合意见和预测问题再分别反馈给专家,再次征询意见,各专家依据综合意见修改自己原有的意见,然后再汇总。这样多次反复,逐步取得比较一致的预测结果的决策方法。

      德尔菲法依据系统的程序,采用匿名发表意见的方式,即专家之间不得互相讨论,不发生横向联系,只能与调查人员发生关系,通过多轮次调查专家对问卷所提问题的看法,经过反复征询、归纳、修改,最后汇总成专家基本一致的看法,作为预测的结果。这种方法具有广泛的代表性,较为可靠。

    德尔菲法的起源演变

    • 起源

      德尔菲法是在20世纪40年代由赫尔默(Helmer)和戈登(Gordon)首创,1946年,美国兰德公司为避免集体讨论存在的屈从于权威或盲目服从多数的缺陷,首次用这种方法用来进行定性预测,后来该方法被迅速广泛采用。20世纪中期,当美国政府执意发动朝鲜战争的时候,兰德公司又提交了一份预测报告,预告这场战争必败。政府完全没有采纳,结果一败涂地。从此以后,德尔菲法得到广泛认可。

      德尔菲是古希腊地名。相传太阳神阿波罗(Apollo)在德尔菲杀死了一条巨蟒,成了德尔菲主人。在德尔菲有座阿波罗神殿,是一个预卜未来的神谕之地,于是人们就借用此名,作为这种方法的名字。

    • 演变

      德尔菲法最初产生于科技领域,后来逐渐被应用于任何领域的预测,如军事预测、人口预测、医疗保健预测、经营和需求预测、教育预测等。此外,还用来进行评价、决策、管理沟通和规划工作。

    德尔菲法的典型特征

      (1) 吸收专家参与预测,充分利用专家的经验和学识;

      (2) 采用匿名或背靠背的方式,能使每一位专家独立自由地作出自己的判断;

      (3) 预测过程几轮反馈,使专家的意见逐渐趋同。

      德尔菲法的这些特点使它成为一种最为有效的判断预测法。

    德尔菲法的特征

    1. 资源利用的充分性。由于吸收不同的专家与预测,充分利用了专家的经验和学识;
    2. 最终结论的可靠性。由于采用匿名或背靠背的方式,能使每一位专家独立地做出自己的判断,不会受到其他繁杂因素的影响;
    3. 最终结论的统一性。预测过程必须经过几轮的反馈,使专家的意见逐渐趋同。

      正是由于德尔菲法具有以上这些特点,使它在诸多判断预测或决策手段中脱颖而出。这种方法的优点主要是简便易行,具有一定科学性和实用性,可以避免会议讨论时产生的害怕权威随声附和,或固执己见,或因顾虑情面不愿与他人意见冲突等弊病;同时也可以使大家发表的意见较快收敛,参加者也易接受结论,具有一定程度综合意见的客观性。

    德尔菲法的具体实施步骤

    1. 组成专家小组。按照课题所需要的知识范围,确定专家。专家人数的多少,可根据预测课题的大小和涉及面的宽窄而定,一般不超过20人。
    2. 向所有专家提出所要预测的问题及有关要求,并附上有关这个问题的所有背景材料,同时请专家提出还需要什么材料。然后,由专家做书面答复
    3. 各个专家根据他们所收到的材料,提出自己的预测意见,并说明自己是怎样利用这些材料并提出预测值的。
    4. 将各位专家第一次判断意见汇总,列成图表,进行对比,再分发给各位专家,让专家比较自己同他人的不同意见,修改自己的意见和判断。也可以把各位专家的意见加以整理,或请身份更高的其他专家加以评论,然后把这些意见再分送给各位专家,以便他们参考后修改自己的意见。
    5. 将所有专家的修改意见收集起来,汇总,再次分发给各位专家,以便做第二次修改。逐轮收集意见并为专家反馈信息是德尔菲法的主要环节。收集意见和信息反馈一般要经过三、四轮。在向专家进行反馈的时候,只给出各种意见,但并不说明发表各种意见的专家的具体姓名。这一过程重复进行,直到每一个专家不再改变自己的意见为止。
    6. 对专家的意见进行综合处理。

    德尔菲法实施注意事项

      ① 由于专家组成成员之间存在身份和地位上的差别以及其他社会原因,有可能使其中一些人因不愿批评或否定其他人的观点而放弃自己的合理主张。要防止这类问题的出现,必须避免专家们面对面的集体讨论,而是由专家单独提出意见。

      ② 对专家的挑选应基于其对企业内外部情况的了解程度。专家可以是第一线的管理人员,也可以是企业高层管理人员和外请专家。例如,在估计未来企业对劳动力需求时,企业可以挑选人事、计划市场生产及销售部门的经理作为专家。

    • 其他注意事项:

      (1) 为专家提供充分的信息,使其有足够的根据做出判断。例如,为专家提供所收集的有关企业人员安排及经营趋势的历史资料和统计分析结果等等。

      (2) 所提问的问题应是专家能够回答的问题。

      (3) 允许专家粗略的估计数字,不要求精确。但可以要求专家说明预计数字的准确程度。

      (4) 尽可能将过程简化,不问与预测无关的问题。

      (5) 保证所有专家能够从同一角度去理解员工分类和其他有关定义。

      (6) 向专家讲明预测对企业和下属单位的意义,以争取他们对德尔菲法的支持。

    德尔菲法的应用

      如某书刊经销商采用德尔菲法对某一专著销售量进行预测。该经销商首先选择若干书店经理、书评家、读者、编审、销售代表和海外公司经理组成专家小组。将该专著和一些相应的背景材料发给各位专家,要求大家给出该专著最低销售量、最可能销售量和最高销售量三个数字,同时说明自己作出判断的主要理由。将专家们的意见收集起来,归纳整理后返回给各位专家,然后要求专家们参考他人的意见对自己的预测重新考虑。专家们完成第一次预测并得到第一次预测的汇总结果以后,除书店经理B外,其他专家在第二次预测中都做了不同程度的修正。重复进行,在第三次预测中,大多数专家又一次修改了自己的看法。第四次预测时,所有专家都不再修改自己的意见。因此,专家意见收集过程在第四次以后停止。最终预测结果为最低销售量26万册,最高销售量60万册,最可能销售量46万册。

      德尔菲法作为一种主观、定性的方法,不仅可以用于预测领域,而且可以广泛应用于各种评价指标体系的建立和具体指标的确定过程。

      例如,我们在考虑一项投资项目时,需要对该项目的市场吸引力作出评价。我们可以列出同市场吸引力有关的若干因素,包括整体市场规模、年市场增长率、历史毛利率竞争强度、对技术要求、对能源的要求、对环境的影响等。市场吸引力的这一综合指标就等于上述因素加权求和。每一个因素在构成市场吸引力时的重要性即权重和该因素的得分,需要由管理人员的主观判断来确定。这时,我们同样可以采用德尔菲法。

    德尔菲法的优缺点

      德尔菲法同常见的召集专家开会、通过集体讨论、得出一致预测意见的专家会议法既有联系又有区别。德尔菲法能发挥专家会议法的优点,即

    1. 能充分发挥各位专家的作用,集思广益,准确性高。
    2. 能把各位专家意见的分歧点表达出来,取各家之长,避各家之短。

      同时,德尔菲法又能避免专家会议法的缺点:

    1. 权威人士的意见影响他人的意见;
    2. 有些专家碍于情面,不愿意发表与其他人不同的意见;
    3. 出于自尊心而不愿意修改自己原来不全面的意见。

      德尔菲法的主要缺点是过程比较复杂,花费时间较长

    德尔菲法与其他决策法相比较

    效果标准/决策方法互动群体法脑力激荡法名义群体法德尔菲法电子会议法
    观点的数量中等
    观点的质量中等
    社会压力中等
    财务成本
    决策速度中等中等中等
    任务导向
    潜在的人际冲突中等
    成就感从高到低中等
    对决策结果的承诺不适用中等
    群体凝聚力中等

    互动群体法有助于增强群体内部的凝聚力脑力激荡法可以使群体的压力降到最低,德尔菲法能使人际冲突趋于最小,电子会议法可以较快的处理各种观点。

    德尔菲法案例分析

    案例一:德尔菲法应用案列[1]

      某公司研制出一种新兴产品,现在市场上还没有相似产品出现,因此没有历史数据可以获得。公司需要对可能的销售量做出预测,以决定产量。于是该公司成立专家小组,并聘请业务经理、市场专家和销售人员等8位专家,预测全年可能的销售量。8位专家提出个人判断,经过三次反馈得到结果如下表所示。

    专家编号第一次判断第二次判断第三次判断
     最低销售量最可能销售量最高销售量最低销售量最可能销售量最高销售量最低销售量最可能销售量最高销售量
    1150750900600750900550750900
    2200450600300500650400500650
    3400600800500700800500700800
    4750900150060075015005006001250
    5100200350220400500300500600
    6300500750300500750300600750
    7250300400250400500400500600
    8260300500350400600370410610
    平均数345500725390550775415570770
    • 平均值预测:

      在预测时,最终一次判断是综合前几次的反馈做出的,因此在预测时一般以最后一次判断为主。则如果按照8位专家第三次判断的平均值计算,则预测这个新产品的平均销售量为:(415+570+770)/3=585

    • 加权平均预测:

      将最可能销售量、最低销售量和最高销售量分别按0.50、0.20和0.30的概率加权平均,则预测平均销售量为:570*0.5+415*0.2+770*0.3=599

    • 中位数预测:

      用中位数计算,可将第三次判断按预测值高低排列如下:

      最低销售量:

      300 370 400 500 550

      最可能销售量:

      410 500 600 700 750

      最高销售量:

      600 610 650 750 800 900 1250

      最高销售量的中位数为第四项的数字,即750。

      将可最能销售量、最低销售量和最高销售量分别按0.50、0.20和0.30的概率加权平均,则预测平均销售量为:

      600*0.5+400*0.2+750*0.3=695

    案例二:德尔菲法在企业人力资源预测中的运用[2]

      国美公司专业生产电声产品,在20世纪80年代早期,国美凭借自己在行业内技术工艺的领先,迅速在国内市场上占据领先的地位,但由于国内市场管理混乱,假冒产品大行其道,加上三角债问题,使国美在20世纪80年代后期开始逐步放弃了国内市场,转而做OEM出口。近些年,由于电声行业的整体需求加大,加之欧美企业关闭自己的生产厂转向国内采购,使国美在近10年来得到快速发展,近年公司销售额每年以平均26%的速度增长。截至2001年3月,公司销售收入达28063万元,员工总数达2315人。

      表1:近年来公司各部门人员变动情况(单位:万元;人)

    Image:表1:近年来公司各部门人员变动情况.jpg

      1997年来公司各部门人员变动情况如表1。国美公司内部组织结构变动较频繁:

      (1)成立综合办。1998年公司精简机构,将人事部后勤人员)人划出。2000年将总结办的网络管理人员6人合并重组为综合办。

      (2)撤消市场部。1999年公司将负责内销的13人调出,6人去了总经办,7人去了物料部;2001年公司又将市场部剩余的22人并入物料部。

      (3)扩大质管部。2000年公司将派往供应商IQCQC人员13人划归质管部管理。

      (4)ERP的导入。2000年公司导入ERP,物料部10名打单员划入财务部管理。

      一、预测

      1、统计方法的预测结果

      本研究通过先后以销售总量(X1)、销售总额(X2)、销售利润(X3)、出口创汇(X4)为自变量对各部门人员变量进行回归。获取的数据为1997-2000年,采用的统计分析软件为社会科学统计软件包(SPSS)和统计分析软件包(SAS)。通过计算机的处理和分析,得到以下回归方程:

      (1)总经办人员预期数量:Y1=0.0085*X1-0.0026*X3-0.0065*X4+9.151

      (其中Y1为总经办人员预期数量,X1、X2、X3、X4分别为销售总量、销售总额、销售利润和出口创汇,下同)

      (2)财务部人员预期数量:Y2=0.0189*X1+0.007743*X3-0.014*X4-18.548

      (3)市场部人员预期数量:Y3=0.008797*X1-0.0027*X3-0.0068*X4+12.958

      (4)物料部人员预期数量:Y4=0.02667*X1-0.00039*X3-0.013*X4-25.39

      (5)人事部人员预期数量:Y5=*0.0045*X1-0.0019*X3-0.0032*X4+4.716

      (6)生产部人员预期数量:Y6=*0.01794*X1+0.0043*X3-0.0087*X4-22.759

      (7)技术部人员预期数量:Y7=-0.0054*X1+0.0026*X3+0.0034*X4+31.106

      (8)质管部人员预期数量:Y8=0.00160*X1+0.001818*X3-0.0012*X4+5.915

      最后得出公司2001-2002的各部门人员需求预测数据(表2):

      表2:统计方法得出的2001-2002年各部门人员需求预测数据

    Image:表2:统计方法得出的2001-2002年各部门人员需求预测数据.jpg

      国美公司各部门人员的历史数据变动性较大,利用回归分析方法进行预测得出的结果显然与实际情况距离较远。因此公司决定采用德尔菲法进行预测。

      2、德尔菲法预测过程与结果

      首先,作预测筹划工作,包括:确定预测的课题及各预测项目:设立负责预测组织工作的临时机构;选择若干名熟悉所预测课题的专家。2001年3月,公司选择了8位企业内部专家参与预测,包括正副总经理4名,人事、物料、质管、生产经理各一名,他们对企业运作和各部门人员结构都非常熟悉。然后公司召开了专家会议,明确了预测项目、进程和注意事项。

      然后,由专家进行预测。公司把包含预测项目的预测及有关背景材料,包括公司组织架构及岗位编制图、1997年以来公司各部门变动与人员流动图、公司未来2年发展规划、预测表等资料发给专家,由各位专家独立作出预测。

      再后,进行统计与反馈。专家意见汇总后,对各专家意见进行统计分析,综合成新的预测表,并把它再分别寄送给各位专家,由专家们对新预测表作出第二轮判断或预测。如此反复,经过三轮,专家的意见趋于一致。

      最后,表述预测结果。把经过几轮专家预测而形成的结果如下表:

    Image:表3:国美公司2002年各部门人数预测.jpg

      预测结束时间为2001年4月,将当时的预测人数与2002年10月的实际人数比较,预测结果基本正确。

    Image:表4:国美公司2002年各类人员人数预测.jpg

      在预测中,我们还对包括产品开发人员、财务人员、市场专员、管工、管理人员、职能人员、技术人员等各类人员的2002需求情况进行了预测。从表4可看出,当时的预测人数与目前的实际人数也基本一致。

      二、讨论

      1、德尔菲法是目前企业人力资源需求短期预测中使用最广、有效性最好的方法之一

      人力资源需求预测有两类不同方法:一种是定量方法,一种是定性方法。定量的方法包括比率预测法统计分析法,这类方法往往合适于相对稳定的企业,而无法考虑企业业务策略和市场条件的变化。定性的方法主要有名义团体法和德尔菲法。

      在国外企业实践中,不少公司喜欢用定量的方法进行预测,如采用线性回归或多元回归方法,通过建立各种简单的或复杂的预测模型,将未来人员需求是与销售额等经济指标的增加联系起来考虑。从美国企业来看,更多的公司喜欢采用定性的方法进行预测,如许多公司喜欢利用名义团体法,由高层管理者和专家组成小组,围绕公司业务战略、企业和行业销售状况、资本风险等因素的变化,通过开会来共同预测公司未来的人力需求情况。但由于担心缺乏衡量预测数据的客观标准,和与会者之间人际关系群体压力等因素,许多大公司都喜欢采用德尔菲法!

    Image:表5:德尔菲法与定量方法的比较.jpg

      与定量方法相比,德尔菲法无疑是一种更适合当前大多数企业的预测方法。

      首先,从内部组织因素来看,企业的组织业务、技术结构总是处于不断变动中,定量方法显然无法预测这种动态环境下人力资源需求趋势。

      其次,从外部环境因素来看,目前企业的市场环境和政策等因素也是在不断变化的,单纯用统计模型的方法,依据过去的一些数据来预测未来人力需求趋势,很难涵括各种复杂的变化因素。

      第三,从有效性和准确的角度来讲,定量方法的准确性多数情况下也低于德尔菲法,卡尔科维奇(1972)指出:德尔菲法预测的购买者需求和实际雇佣人数之间的一致性,明显比回归分析所揭示的预测要准确。

      2、使用德尔菲法应注意的问题

      (1)尽量避免专家在预测中倾向性选择信息和冒险心理效应。在本次预测的后两轮,从统计数据可以看出,不少专家有一种压低预测人数的倾向,不管是职能人员人数,还是技术人员人数,都预估得过低。因此,在预测的专家培训中,必须强调各自的独立判断;在预测过程中,应注意保密,避免人际压力的影响。最好的办法是由独立的机构而不是人力资源部来汇总、处理信息。

      (2)与名义团体法配套使用。德尔菲法的难点在于如何提出简单明了的问题,如何使专家对预测中涉及的各种概念和指标理解一致,以及如何将专家意见归纳总结。如果在预测前能对专家进行全面的培训,预测后再集中专家采用名义团体法进行讨论,最后达成一致意见,效果会更好。

    相关条目

    参考文献

    1.  统计预测与决策(第二版) - 德尔菲法(上海财经大学教学课件)
    2.  刘善仕.德尔菲法在企业人力资源预测中的运用.企业经济.2003/02
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    黑盒测试

    黑盒测试又叫功能测试、数据驱动测试或给予需求规格说明书的功能测试。这种测试注重于测试软件的功能性需求。

    采用这种测试方法,测试工程师把测试对象看作一个黑盒子,不需要考虑程序内部的逻辑结构和特性,只需要依据程序的需求规格说明书,检查程序的功能是否符合它的功能说明。黑盒测试能更好更真实的从用户角度来考察被测系统的功能性需求实现情况。在软件测试的各个阶段,如单元测试、集成测试、系统测试及确认测试等阶段都发挥着重要作用。尤其在系统测试和确认测试中,其作用是其他测试方法无法取代的。

    白盒测试

    白盒测试又称结构测试、逻辑驱动测试或基于程序代码内部结构的测试。此时,需要深入考察程序代码的内部结构、逻辑设计等等。白盒测试需要测试工程师具备很深的软件开发工地,精通相应的开发语言,一般的软件测试工程师难以胜任该工作。

    静态测试

    静态测试,顾名思义,就是静态的、不执行被测对象程序代码而寻找缺陷的过程。通俗地讲,静态测试就是用眼睛看,阅读程序代码,文档资料等,与需求规格说明书中的需求进行比较,找出程序代码中设计的不合理,以及文档资料中的错误。

    在进行代码的静态测试时,可以采用一些代码走查的工具,如 QA C++、C++ Test等。

    动态测试

    动态测试即为实际的执行被测对象的程序代码,输入事先设计好的测试用例,检查程序代码运行的结果与测试用例中设计的预期结果之间是否差异,判定实际结果与预期结果是否一致,从而检验程序的正确性、可靠性和有效性,并分析系统运行效率和健壮性等性能状况。

    动态测试由四部分组成:设计测试用例、执行测试用例、分析比较输出结果、输出测试报告。

    动态测试结合使用白盒测试和黑盒测试。

     

    2.    测试方法

    对于白盒测试,常用的测试方法有:语句覆盖、判定覆盖、条件覆盖、判定/条件覆盖、多重条件覆盖等等。黑盒测试较为知名的测试方法有:等价类划分、边界值分析、因果图分析、错误猜测等。本章将对这些测试方法进行一些简单的介绍。

    2.1  白盒测试

    白盒测试关注的是测试用例执行的程度或覆盖程序逻辑结构(源代码) 的程度。如完全的白盒测试是将程序中每条路径都执行到,然而对一个带有循环的程序来说,完全的路径测试并不切合实际。

                                                                                        


    2‑1被测试的小程序

    2.1.1    语句覆盖

    如果完全从路径测试中跳出来看,那么有价值的目标似乎就是将程序中的每条语句至少执行一次。遗憾的是,这恰是合理的白盒测试中较弱的准则。图2‑1描述了这种思想。假设图2‑1 代表了一个将要进行测试的小程序,其等价的代码段如下:

    Public void foo(int a, int b, int x)

    {

    if (a > 1 &&b == 0)

    {

            x = x/ a;

        }

    if (a == 2 || x > 1)

    {

           X = x +1;

        }

    }

    通过编写单个的测试用例遍历程序路径 ace,可以执行到每一条语句。也就是说,通过在点 a 处设置 A=2,B=0,X=3,每条语句将被执行一次(实际上,X 可被赋任何值)。

    遗憾的是,这个准则相当不足。举例来说,也许第一个判断应是“或”,而不是 “与” 。 如果这样, 这个错误就会发现不到。另外, 可能第二个判断应该写成 “X>0” ,这个错误也不会被发现。还有,程序中存在一条 X 未发生改变的路径(路径 abd),如果这是个错误,它也不会被发现。换句话说,语句覆盖这条准则有很大的不足,以至于它通常没有什么用处。

    2.1.2    判定(分支)覆盖

    判定覆盖或分支覆盖是较强一些的逻辑覆盖准则。该准则要求必须编写足够的测试用例,使得每一个判断都至少有一个为“真”和为“假”的输出结果。换句话说,也就是每条分支路径都必须至少遍历一次。分支或判定语句的例子包括switch,do-while 和 if-else 语句。

    判定覆盖通常可以满足语句覆盖。由于每条语句都是在要么从分支语句开始,要么从程序入口点开始的某条子路径上,如果每条分支路径都被执行到了,那么每条语句也应该被执行到了。但是,仍然有些例外情况:

    •  程序中不存在判断。

    •  程序或子程序/方法有着多重入口点。只有从程序的特定入口点进入时,某条特定的语句才能执行到。

    我们的探讨仅针对有两个选择的判断或分支,当程序中包含有多重选择的判断时,判定/分支覆盖准则的定义就必须有所改变。典型的例子有包含select(case)语句的 Java 程序,包含算术 (三重选择) IF 语句、计算或算术 GOTO 语句的 FORTRAN 程序,以及包含可选 GOTO 语句或 GO-TO-DEFENDING-ON 语句的 COBOL 程序。对于这些程序,判定/分支覆盖准则将所有判断的每个可能结果都至少执行一次,以及将程序或子程序的每个入口点都至少执行一次。

    在图2‑1 中,两个涵盖了路径 ace 和 abd,或涵盖了路径 acd 和 abe 的测试用例就可以满足判定覆盖的要求。如果我们选择了后一种情况,两个测试用例的输入是 A=3,B=0,X=3 和 A=2,B=1,X=1。

    判定覆盖是一种比语句覆盖更强的准则,但仍然相当不足。举例来说,我们仅有 50%的可能性遍历到那条 X 未发生变化的路径(也即, 仅当我们选择前一种情况) 。

    如果第二个判断存在错误(例如把 X>1 写成了 X<1,那么前面例子中的两个测试用例都无法找出这个错误。

    2.1.3    条件覆盖

    比判定覆盖更强一些的准则是条件覆盖。在条件覆盖情况下,要编写足够的测试用例以确保将一个判断中的每个条件的所有可能的结果至少执行一次。因为,就如同判定覆盖的情况一样,这并不总是能让每条语句都执行到,因此作为对这条准则的补充就是对程序或子程序。举例来说,分支语句

    DO K=0 to 50 WHILE (J+K<QUEST)

    包含两种情况:K 是否小于或等干 50?以及 J+K 是否小于 QUEST? 因此,需要针对K  <=  50、 K  >50 (达到循环的最后一次迭代)以及J+K<QUEST、 J+K>=QUEST的情况设计测试用例。

    图 2‑1 有四个条件:A>1、B=0、A=2 以及 X>1。因此需要足够的测试用例,使得在点 a 处出现 A=2、A<2、X>1 及 X<=1 的情况。有足够数量的测试用例满足此准则,用例及其遍历的路径如下所示:

    1.A=2,B=0,X=4  ace

    2.A=1,B=1,X=1  adb

    请注意,尽管在本例中生成的测试用例数量是一样的,但条件覆盖通常还是要比判定覆盖更强一些。因为,条件覆盖可能(但并不总是这样)会使判断中的各个条件都取到两个结果(“真”和“假” ) ,而判定覆盖却做不到这一点。举例来说,在相同的分支语句

    DO  K=0 to 50 WHILE(J+K<QUEST)

    中,存在一个两重分支(执行循环体,或者跳过循环体) 。如果使用的是判定覆盖测试,将循环从 K= 0 执行到 K = 51 即可满足该准则,但从未考虑到 WHILE子句为假的情况。如果使用的是条件覆盖准则,就需要设计一个测试用例为J+K<QUEST 产生一个为假的结果。

    虽然条件覆盖准则乍看上去似乎满足判定覆盖准则,但并不总是如此。如果正在测试判断条件 IF (A&B),条件覆盖准则将要求编写两个测试用例:A为真,B为假;A 为假,B 为真。但是这并不能使 IF 语句中的 THEN 被执行到。对图2‑1 所示例子所进行的条件覆盖测试涵盖了全部判断结果,但这仅仅是偶然情况。举例来说,两个可选的测试用例:

    1. A=2,B=0,X=3

    2. A=1,B=1,X=1

    涵盖了全部的条件结果,却仅涵盖了四个判断结果中的两个(这两个测试用例都涵盖到了路径 abe,因而不会执行第一个判断结果为真的路径,以及第二个判断结果为假的路径) 。

    2.1.4    判定/条件覆盖

    显然,解决上面左右为难局面的办法就是所谓的判定/条件覆盖准则。这种准则要求设计出充足的测试用例。将一个判断中的每个条件的所有可能的结果至少执行一次,将每个判断的每个条件的所有可能的结果至少执行一次,将每个判断的所有可能的结果至少执行一次,将每个入口点都至少调用一次。

    判定/条件覆盖准则的一个缺点是尽管看上去所有条件的所有结果似乎都执行到了,但由于有些特定的条件会屏蔽掉其他的条件,常常并不能全部都执行到。请参见图2‑2来观察此种情况。图2‑2 中的流程图描述的是编译器将图2‑1中的程序编译生成机器代码的过程。源程序中的多重条件判断被分解成单个的判断和分支,因为大多数的机器都没有能执行多重条件判断的单独指令。那么,更为完全的测试覆盖似乎是将每个基本判断的全部可能的结果都执行到,而前两个判定覆盖的测试用例都做不到这点,它们未能执行到判断 I 中的结果为 “假”的分支, 以及判断 K 中结果为“真”的分支。


                                                                      

    2‑2 图 2‑1中程序的机器码

    如图2‑2所示,其中的原因是“与”和“或”表达式中某些条件的结果可能会屏蔽掉或阻碍其他条件,的判断。举例来说,如果“与”表达式中有个条件为“假”,那么就无须计算该表达式中的后续条件。 同样, 如果 “或”表达式中有个条件为 “真” ,那么后续条件也无须计算。因此,条件覆盖或判定/条件覆盖谁都不一定会发现逻辑表达式中的错误。

    2.1.5    多重条件覆盖

    所谓的多重条件覆盖准则能够部分解决这个问题。该准则要求编写足够多的测试用例,将每个判定中的所有可能的条件结果的组合,以及所有的入口点都至少执行一次。举例来说,考虑下面的伪代码程序;

    NOTFOUND=TRUE;

    DO I=1 TO TABSIZE WHILE (NOTFOUND); /*SEARCHTABLE*/

     ……searching logic……;

    END

    要测试四种情况:

    1.  I<=TABSIZE,并且 NOTFOUND 为真;

    2.  I<=TABSIZE,并且 NOTFOUND 为假(在到达表格尾部前查询指定条目) ;

    3.  I>TABSIZE,并且 NOTFOUND 为真(查询了整个表格,未找到指定条目) ;

    4.  I>TABSIZE,并且 NOTFOUND 为假(指定条目位于表格的最后位置) 。

    很容易发现,满足多重条件覆盖准则的测试用例集,同样满足判定覆盖准则、条件覆盖准则以及判定/条件覆盖准则。

    再次回到图2‑1中,测试用例必须覆盖以下 8 种组合:

    1.      A > 1,  B  =  0

    2.      A > 1,  B !=  0

    3.      A <= 1,B  =  0

    4.      A <= 1,   B != 0

    5.      A = 2,  X >  1

    6.      A = 2,  X <= 1

    7.      A != 2, X  >  1

    8.      A != 2, X <= 1

    注意,第 5 至8 组合表示了第二个 if 语句的值。由于 X可能在该 if 语句之前发生了改变,因此这个 if 语所需的值必需对程序逻辑进行回溯,以找到相对应的输入值,要测试的这 8 种组合并不一定意味着需要设计出 8 个测试用例。实际上,用 4 个测试用例就可以覆盖它们。下面是这些测试用例的输入,以及它们覆盖的组合:

    A=3,B=0,X=4 覆盖组合 1,5

    A=2,B=1,X=1 覆盖组合 2,6

    A=1,B=0,X=2 覆盖组合 3,7

    A=1,B=1,X=1 覆盖组合 4,8

    图 2‑1的程序存在 4 条不同的路径,需要 4 个测试用例,这样的情况纯属巧合。事实上,这 4 个用例也没有覆盖到每条路径,路径 acd 就被遗漏掉了。

    举例来说,对于如下所示的判断语句,尽管它只包舍两条路径,仍可能需要 8个测试用例:

    if (x==y && length(z)==0 && FLAG)

    {

    j=1 ;

    }

    Else

    {

        i=1;

    }

    在存在循环的情况下,多重条件覆盖准则所需要的测试用例的数量通常会远远小于其路径的数量。

    总的来说,对于包含每个判断只存在一种条件的程序,最简单的测试准则就是设计出足够数量的测试用例,实现:(1)将每个判断的所有结果都至少执行一次;(2)将所有的程序入口都至少调用一次,以确保全部的语句都至少执行一次。而对于包含多重条件判断的程序,最简单的测试准则是设计出足够数量的测试用例,将每个判断的所有可能的条件结果的组合,以及所有的入口点都至少执行一次(加入“可能”二字,是因为有些组合情况难以生成)。

    2.1.6    路径覆盖

    在以上测试用例中,我们发现漏掉了路径acd。路径覆盖则要求覆盖程序所有可能的路径,路径覆盖需要对所有可能的路径进行测试(包括循环、条件组合、分支选择等)。那么需要设计大量、复杂的测试用例,使得工作量呈指数级增长。而在有些情况下,一些执行路径是不可能被执行的。

    从这个简单的例子可以看出,要想充分测试一个程序是很困难的。同时,测试条件越强,测试的代价越高。测试时应分主次,在测试代价和测试充分性之间做出平衡。

    2.2  黑盒测试

    2.2.1    等价划分

    一个好的测试用例描述为具有相当高的可能性发现某个错误来,此外对程序的穷举输入测试是无法实现的。因此,当测试某个程序时,我们就被限制在从所有可能的输入中努力找出某个小的子集。理所当然,我们要找的子集必须是正确的,并且是可能发现最多错误的子集。确定这个子集的一种方法,就是要意识到一个精心挑选的测试用例还应具备另外两个特性:

    1.  严格控制测试用例的增加,减少为达到“合理测试”的某些既定目标而必须设计的其他测试用例的数量。

    2.  它覆盖了大部分其他可能的测试用例。也就是说,它会告诉我们,使用或不使用这个特定的输入集合,哪些错误会被发现,哪些会被遗漏掉。

    虽然这两个特性看起来很相似,但描述的却是截然不同的两种思想。第一个特性意味着,每个测试用例都必须体现尽可能多的不同的输入情况,以使最大限度地减少测试所需的全部用例的数量。而第二个特性意味着应该尽量将程序输入范围进行划分,将其划分为有限数量的等价类,这样就可以合理地假设(但是,显然不能绝对肯定)测试每个等价类的代表性数据等同于测试该类的其他任何数据。也就是说,如果等价类的某个测试用例发现了某个错误,该等价类的其他用例也应该能发现同样的错误。相反,如果测试用例没能发现错误,那么我们可以预计,该等价类中的其他测试用例不会出现在其他等价类中,因为等价类是相互交迭的。

    这两种思想形成了称为等价划分的黑盒测试方法。第二种思想可以用来设计一个“令人感兴趣的”输入条件集合以供测试,而第一个思想可以随后用来设计涵盖这些状态的一个最小测试用例集。

    使用等价划分方法设计测试用例主要有两个步骤:(1)确定等价类; (2)生成测试用例。

    2‑1等价类列举表

    输入条件

    有效等价类

    无效等价类

     

     

     

    1.确定等价类

    确定等价类是选取每一个输入条件(通常是规格说明中的一个句子或短语)并将其划分为两个或更多的组。可以使用表2‑1中的表格来进行划分。注意,我们确定了两类等价类:有效等价类代表对程序的有效输入,而无效等价类代表的则是其他任何可能的输入条件(即不正确的输入值)。这样,我们遵循了测试原则,即要注意无效和未预料到的输入情况。

    在给定了输入或外部条件之后,确定等价类大体上是一个启发式的过程。下面给出了一些指导原则:

    1.  如果输入条件规定了一个取值范围(例如,“数量可以是从1到999”),那么就应确定出一个有效等价类 (1<数量<999 ) ,以及两个无效等价类 (数量<1,数量>999) 。

    输入条件

    有效等价类

    无效等价类

    取值范围

    1<数量<999

    数量<1,数量>999

     

    2.  如果输入条件规定了取值的个数(例如,“汽车可登记一至六名车主”),那么就应确定出一个有效等价类和两个无效等价类(没有车主,或车主多于六个)。

    输入条件

    有效等价类

    无效等价类

    取值个数

    1至六名车主

    没有车主,车主多于六个

     

    3.  如果输入条件规定了一个输入值的集合,而且有理由认为程序会对每个值进行不同处理(例如,“交通工具的类型必须是公共汽车、卡车、出租车、火车或摩托车” ) ,那么就应为每个输入值确定一个有效等价类和一个无效等价类(例如,“拖车” ) 。

    输入条件

    有效等价类

    无效等价类

    输入值集合

    公共汽车,卡车,出租车,火车,摩托车

    拖车

     

    4.  如果存在输入条件规定了“必须是”的情况,例如“标识符的第一个字符必须是字母”,那么就应确定一个有效等价类(首字符是字母)和一个无效等价类(首字符不是字母) 。

    输入条件

    有效等价类

    无效等价类

    第一个字符

    首字符是字母

    首字符不是字母

    如果有任何理由可以认为程序并未等同地处理等价类中的元素,那么应该将这个等价类再划分为小一些的等价类。

    2.生成测试用例

    第二步是使用等价类来生成测试用例,我们以上述第一个例子来说明,其过程如下:

    1.    为每个等价类设置一个不同的编号。

    2.  编写新的测试用例,尽可能多地覆盖那些尚未被涵盖的有效等价类,直到所有的有效等价类都被测试用例所覆盖(包含进去)。

    3.  编写新的用例,覆盖一个且仅一个尚未被覆盖的无效等价类,直到所有的无效等价类都被测试用例所覆盖。

    用单个测试用例覆盖无效等价类,是因为某些特定的输入错误检查可能会屏蔽或取代其他输入错误检查。举例来说,如果规格说明规定了“请输入书籍类型(硬皮、软皮或活页)及数量(l~999 )”,代表两个错误输入(书籍类型错误,数量错误)的测试用例“XYZ 0”,很可能不会执行对数量的检查,因为程序也许会提示“XYZ 是未知的书籍类型”,就不检查输入的其余部分了。

    这里将上述的第4个例子进行一下扩展,然后进行示范说明如何用等价类划分的思想来设计测试用例:

    规定标识符的第一个字符必须是字母,标识符只能使用字母、数字和下划线。

    第一步:划分等价类,为每一个等价类编号。

    输入条件

    有效等价类

    无效等价类

    第一个字符

    首字符是字母(1)

    首字符不是字母(2)

    字符限制

    仅使用字母、数字和下划线(3)

    使用了其他字符(4)

    第二步:设计测试用例,覆盖所有有效等价类,用尽可能少的用例覆盖最多的有效等价类。

    测试用例:Test_1                覆盖(1)(3)

     第三步:设计测试用例,覆盖所有无效等价类。每新增一个测试用例,只覆盖一个无效等价类。

    测试用例:123test               覆盖(2)

    测试用例:Test#¥              覆盖(4)

    2.2.2    边界值分析

    经验证明,考虑了边界条件的测试用例与其他没有考虑边界条件的测试用例相比,具有更高的测试回报率。所谓边界条件,是指输入和输出等价类中那些恰好处于边界、或超过边界、或在边界以下的状态。边界值分析方法与等价划分方法存在两方面的不同:

    1.  与从等价类中挑选出任意一个元素作为代表不同,边界值分析需要选择一个或多个元素,以便等价类的每个边界都经过一次测试。

    比如要求输入职工年龄,规定输入为18 – 45。根据等价类划分思想,一个有效等价类:18<= 年龄 <=45 ,两个无效等价类:年龄<18 和 年龄>45。这样选取 10 ,30 ,50即可满足覆盖。但是等价类的思想没有从边界值方面来分析问题,从边界值角度分析,我们就会再添加17、18、19 、44、45、46这样的边界值。

     

    2.  与仅仅关注输入条件(输入空间)不同,还需要考虑从结果空间(输出等价类)设计测试用例。

     比如ATM机取款手续费为取款额%1,最低2元,最高50元。从输出等价类来考虑边界值,就要设计用例来测试手续费会不会低于2元,会不会高于50元。

    很难提供一份如何进行边界值分析的“详细说明’,因为这种方法需要一定程度的创造性,以及对问题采取一定程度的特殊处理办法(因此,就像测试的许多其他方面一样,这更多的是项智力工作,并非其他的什么)。

    2.2.3    因果图

    边界值分析和等价划分的一个弱点是未对输入条件的组合进行分析。边界值测试不一定能检查出此类错误。

    对输入组合进行测试并不是简单的事情,因为即使对输入条件进行了等价划分,这些组合的数量也是个天文数字。如果在选择输入条件的子集时没有采用一个系统的方法,很可能选择出一个任意的输入条件子集, 这样会使测试没有什么成效。 

    因果图有助于用一个系统的方法选择出高效的测试用例集。它还有一个额外的好处,就是可以指出规格说明的不完整性和不明确之处。

    这里不对因果图这种方法进行详细介绍,有兴趣的同事可以查阅《软件测试的艺术》相关章节。

    2.2.4    错误猜测

    常常可以看到这种情况,有些人似乎天生就是测试的能手。这些人没有用到任何特殊的方法(比如对因果图进行边界值分析),却似乎有着发现错误的诀窍。

    对此的一个解释是这些人更多是在下意识中,实践着一种称为错误猜测的测试用例设计技术。接到具体的程序之后,他们利用直觉和经验猜测出错的可能类型,然后编写测试用例来暴露这些错误。

    由于错误猜测主要是一项依赖于直觉的非正规的过程,因此很难描述出这种方法的规程。其基本思想是列举出可能犯的错误或错误易发情况的清单,然后依据清单来编写测试用例。例如,程序的输入中出现 0 这个值就是一种错误易发情况。因此,可以编写测试用例,检查特定的输入值中有 0,或特定的输出值被强制为 0 的情况。同样, 在出现输入或输出的数量不定的地方 (如某个被搜索列表的条目数量)。数量为“没有”和“一个” (例如空列表,仅包含一个条目的列表)也是错误易发情况。另一个思想是,在阅读规格说明时联系程序员可能做的假设来确定测试用例(即规格说明中的一些内容会被忽略,要么是由于偶然因素,要么是程序员认为其显而易见)。

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