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  • 可以用于做不基因组学 转录组学和 蛋白组学 等的聚类分析,热图
  • 差异表达基因-火山图和聚类图解释

    万次阅读 2019-02-15 10:40:38
    想研究某现象的分子机制,老板豪气的来一句,先测个转录组吧,看下差异表达...1差异基因筛选方法那差异基因是如何筛选出来的呢?差异基因的筛选方法有很多,包括倍数法、T检验、F检验及SAM等。 下面简单介绍一下GCBI...

    想研究某现象的分子机制,老板豪气的来一句,先测个转录组吧,看下差异表达基因。

    是否在心里窃喜,制个样就完事了,太easy有木有。等大堆数据回来的时候,是不是傻眼了?

    从何下手挑选差异表达基因呢?
    今天就先来聊聊如何看差异表达基因数据,火山图,聚类图又怎么看1差异基因筛选方法那差异基因是如何筛选出来的呢?差异基因的筛选方法有很多,包括倍数法、T检验、F检验及SAM等
    下面简单介绍一下GCBI平台上用的倍数法和SAM法。
    倍数法适用于没有生物学重复的样本,其计算基因在两个条件下表达水平的比值,确定比值的阈值,将绝对值大于此阈值的基因判断为差异基因。
    SAM算法适用于有生物学重复的样本,通过对分母增加一个常量 T 检验过程减小了假阳性发生的概率。文献中报道,相较于其他算法,SAM算法更为稳定,筛选出的结果也更为准确。2差异基因数据解读经过合适的差异基因方法筛选出的差异基因,结果一般分为两部分,数据+图形。
    数据结果展示如下图所示(两分组)众多参数中,重点看三个。

    p-value或q-value

    没有做生物学重复请跳过这一步。
    p-value或q-value是统计学检验变量,代表差异显著性,一般p-value或q-value小于0.05代表具有显著性差异,但可根据具体情况适当调整
    因为p-value或q-value衡量地是某个基因假阳性的概率,如果p-value或q-value越低,那么挑选该基因出现假阳性的概率就越低,可验证性就越高。

    两者具体的计算方法具体如下:那p-value、q-value同时存在时看哪个呢?

    SAM法只有q-value当两者同时存在时,可根据具体情况具体分析。
    差异筛选是一个典型的多重假设检验过程,对于多重假设检验,单次检验中差异显著基因的假阳性率(p-value较小)可能会较大,而q-value和FDR值较常见的BH校正方法得到的FDR值而言,改进了其对假阳性估计的保守性。
    即q-value相比于p-value更加严格,当差异基因结果较少时,可以退而求其次看p-value。Fold ChangeFold Change表示实验组比上对照组的差异表达倍数,一般表达相差2倍以上是有意义的,放宽要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。
    看表达倍数的同时还需结合基因表达丰度,信号值太低的基因会在后续的验证实验中检测不到。3差异基因图表解读在差异结果的图形展示结果中,主要是火山图聚类图。火山图火山图只针对两分组且有生物学重复的情况。
    如何看火山图呢?

    火山图可反映总体基因的表达情况,横坐标代表log2(Fold Change),纵坐标表示-log10(P值),每个点代表一个基因,颜色用以区分基因是否差异表达,图中橙色的点代表差异表达基因,蓝色的点代表没有差异表达的基因。聚类图

    聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性
    如上图所示的聚类图中,横坐标代表样本聚类,一列代表一个样本,聚类基于样本间基因表达的相似性,样本间基因表达越接近,靠的越近,以此类推。
    纵坐标代表基因聚类,一行代表一个基因,聚类基于基因在样本中表达的相似性,基因在样本中表达越接近,靠的越近,以此类推。
    色阶代表基因表达丰度,越红代表上调得越明显,越绿代表下调得越明显。
    如何做聚类图请戳往期推送

    做个聚类图只需1分钟
    差异基因有了,如何挑选潜在基因进行实验验证呢?
    关键还在于感兴趣点在哪了。粗略的看,可以先看KEGG或者GO功能分类,看差异基因具体富集在哪些通路或功能。
    比如关注的是细胞内脂肪酸合成关键酶,可以重点看脂肪酸合成和碳流相关通路。具体如何看KEGG或者GO功能分类,请听下回分解。


    参考

    https://www.cnblogs.com/leezx/p/6601967.html


    DrugAI
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  • 差异表达与聚类分析

    万次阅读 2014-10-13 16:04:45
    然而,于p-value不同的是,q-value衡量的是FalseDISCOVERYRate,对于给定的基因G,q-value给出的是在和基因g一样或更显著的差异基因群体中,假阳性发生的比率。 对 于差异表达类似,在不同条件下共表达的关系也...

    转自:http://blog.sina.com.cn/s/blog_670445240101jn7v.html

    在鉴定出ncRNA后,我们如何推断其可能的生物学功能呢?首先对于miRNA等作用机制比较清楚的ncRNA,我们可以参考其作用机制,利用碱基互补等方式预测其靶标,并进而推断其生物学功能。然而,对于longnon-coding RNA等具体作用机制尚待明确的非编码RNA,这个方法就不适用了。这时,我们可以根据在表达调控网络中,表达相关的基因往往具有功能相似性这一特征,利用表达相关来推断其功能。具体来说,在实际研究中,我们主要关注两类表达关联,在不同条件下差异表达的基因,以及不同条件下共表达的基因。

        在不需要考虑实验误差的理想世界里,差异表达基因检测是很容易的。我们只需要直接比较不同条件下检测出的表达量数值即可。然而,在现实世界中,情况要复杂的多。事实上,在真实的实验过程中,由于随机误差(andomerror)的存在,我们得到的测量值永远是一个分布而非一个定值。因此,不同条件下基因表达水平的比较实质上是对两个分布的比较,换句话说,除了均值之外,我们还需要考虑方差的影响。我们需要利用统计学的方法,基于概率模型进行统计推断。具体来说,我们需要构建一个考虑方差的统计量(tatistic),而后基于这个统计量的零分布(NULLdistribution)来计算每个基因的p-value,最后选择小于给定cut-off p-value的基因作为有统计显著性差异表达的基因。
        针对RNA-Seq数据的特定,不同研究组基于Possion,负二项分布等构造了不同的统计量和差异表达计算的方法。由于这些方法基于不同的假设,其零分布之间也存在显著的差异,从而导致了最终的p-value乃至calling结果的差异。为了便于选择合适的方法。OoronBetel等人基于多组数据集对常用的差异表达工具进行了系统评估。p-value本质上对统计错误可能性的一个概率表示。具体来说,我们在实际中可能会碰到两类错误,一类错误又称假阳性错误,指实际并没有差异表达的基因错当成了有差异表达的基因,二类错误又称假阴性错误,值实际表达有差异的基因错当成了没有差异表达。
    每日一生信--差异表达与聚类分析
     
      一般来说,我们会用p-value表示一次检验中发生一类错误--也就是假阳性的错误--的概率。在实践中,我们通常对多个基因重复进行统计检验。这时就碰到多重检验问题(multipletestinglssue).例如,我们对20个不同的基因一次进行统计检验,每次检验的p-value都为0.05,那么也就是说,我们每次犯错误的概率是0.05,我们不犯错误的概率是0.95,根据乘法原理,连续20次不犯错误的概率就是0.95的20次方,约0.358。我们至少犯一次错误的概率是1-0.358=0.642.也就是说,即使每次出错的概率都是0.05,但20次最终任由超过一半的概率至少犯一次错误。这就是所谓的multipletesting issue.为了解决这个问题,最简单的办法就是将p-value的cut-off改的更严。例如,Bonferronicorrection中,会将检验得到的原始p-value乘以检验进行的次数。因此,假如,我们对人类基因组3万个基因只在原始p-value小于0.05/30000=1.67*10^-6时才将之作为差异表达基因。就可以确保及时在最糟糕的情况下,也可以确保假阳性错误发生的概率小于0.05.然而,在实践中Bonferronicorrection往往过于严格了。为了确保降低假阳性而抬高了假阴性错误发生的概率,从而降低了统计检验的效力(power).同时,相对于全体进行统计检验的基因,我们在实际研究中往往更关心在已经被标记为差异表达的记忆中,有多少假阳性的基因。换句话说,我们关心的是FDR而不是FWER.这时,可以将p-value转变为q-value.类似于p-value,q-value也是对统计错误可能性的表示(measure).然而,于p-value不同的是,q-value衡量的是FalseDISCOVERYRate,对于给定的基因G,q-value给出的是在和基因g一样或更显著的差异基因群体中,假阳性发生的比率。
    于差异表达类似,在不同条件下共表达的关系也可以用来推断基因的功能。对不同条件下多个基因的表达进行聚类分析(clustering)可以帮助快速的选择共表达基因。正确的聚类分析,不但有助于推断基因的功能,还可以有效的发现基因之间存在的调控关系。距离度量是聚类方法的核心。这里的距离度量,是指用来衡量两个基因的表达模式之间的相似程度。常用的距离衡量有欧式距离,又称绝对距离;和Peason距离,又称关联距离。其中欧式距离关心的是表达量,也就是两个基因在表达水平之间的相似程度。而相关性距离则是关心的是表达模式,也就是两个基因在表达变化上的一致性。不同的距离度量,可以得到迥然不同的结果。
    每日一生信--差异表达与聚类分析
        由于共表达通常是指表达的变化趋势,因此在实际分析中关联距离使用的频率更高一些。在应用Pearson距离时,也要注意utlier对它的影响。由于Pearson距离以来于群体水平的协方差,如果有一些特殊的outlier,会对最终的结果产生极大的影响。
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  • 芯片质量分析基因芯片(Affymetrix)分析2:芯片数据预处理基因芯片(Affymetrix)分析3:获取差异表达基因基因芯片(Affymetrix)分析4:GO和KEGG分析基因芯片(Affymetrix)分析5:聚类分析 聚类又称非监督分类...

    聚类又称非监督分类,是一种探索性数据分析(Exploratory Data Analysis, EDA)方法,其目的是把有限数量的事物划分到若干“自然”的类别中。芯片结果的聚类分析很复杂,因为聚类本身就是个复杂的问题,聚类后的结果解析则更复杂。

    在芯片数据分析中为什么要进行基因的聚类分析?主要是为了了解未知基因的功能。通过聚类分析我们把基因按某些特性(表达规律)分成若干类别,聚合成同一类的基因在表达上有相似规律,它们很可能具有某些类似的功能。基于这一假设,我们可以通过了解某一类别中已知功能的基因进一步分析其他未知基因的功能。

    聚类分析方法(算法)大体上可分为层次聚类(hierarchical clustering)和分配聚类(partitional clustering)两种,其中层次聚类在芯片分析中用得比较多。经典的层次聚类也有两种:凝聚式层次聚类法(agglomerative hierarchical clustering)和分裂式层次聚类(divisive hierarchical clustering)。凝聚式层次聚类法先把N个基因当成N个独立的簇(或称群、类),通过逐个合并最相似的项最终归为一个簇;而分裂式层次聚类正好相反。

    R语言发展到今天,研究者为聚类分析软件包的开发做出了大量的贡献(衷心地感谢他们),使用者有很多选择。读者可以从CRAN的Task view页面做进一步的了解。

    1 计算距离:

    先读入我们前面保存的分析数据:

    data.fc <- read.csv("results.lim.all.csv", header=T, row.names=1)
    head(data.fc, 2)
    
    ##               T1h  T24h   T7d
    ## 254818_at  0.3409 6.024 6.215
    ## 245998_at -0.1367 3.676 2.778
    

    R中计算距离的函数为dist( )。但是使用什么指标来计算距离呢?一般通过计算相关系数作为基因间距离,R函数是cor( )。使用fold change计算距离也可以做出图来,其结果显然和用相关系数做出的图不一样:

    par(mfrow=c(2,1))
    par(mar=c(0,4,2,0))
    dist.fc <- dist(data.fc, method="euclidean")
    plot(hclust(dist.fc), hang=-1, labels=FALSE, main="使用Fold-change计算距离", sub="")
    dist.fc <- as.dist(1 - cor(t(data.fc)))
    plot(hclust(dist.fc), hang=-1, labels=FALSE, main="使用相关系数作为距离", sub="")
    

    cor函数计算相关系数是计算矩阵不同列的相关系数,上面代码中函数 t() 对矩阵行列进行了转置,这样计算出的是基因间的相关系数矩阵。设置cor函数的method参数可以计算出pearson, kendall 或 spearman相关系数矩阵,默认计算pearson相关系数。as.dist函数把该矩阵转成了距离(向量)。如果直接使用dist函数计算距离,method可以设置距离计算的类型。

    2 聚类

    上面使用的hclust函数是R基本包中的凝聚式层次聚类函数。分裂式层次聚类运算耗时很长,做高通量数据分析一般不采用。

    凝聚式层次聚类方法首先把N个基因当成N个独立的簇,每合并出一个新簇就为它计算相似系数。那么这个新簇的系数怎么计算?比如Ci和Cj合并后产生Cij,Cij在相似矩阵里面取什么值?这不是生物学研究者该考虑的问题,我们只用现成的。R的hclust函数提供了7中可用方法,"ward", "single", "complete", "average", "mcquitty", "median" 和 "centroid"。

    我们看看其中的6种结果:

    par(mfrow=c(3,2))
    par(mar=c(0,4,2,0))
    plot(hclust(dist.fc, method="complete"), hang=-1, labels=FALSE, main='Method "complete"', sub="")
    plot(hclust(dist.fc, method="single"), hang=-1, labels=FALSE, main='Method "single"', sub="")
    plot(hclust(dist.fc, method="average"), hang=-1, labels=FALSE, main='Method "average"', sub="")
    plot(hclust(dist.fc, method="mcquitty"), hang=-1, labels=FALSE, main='Method "mcquitty"', sub="")
    plot(hclust(dist.fc, method="median"), hang=-1, labels=FALSE, main='Method "median"', sub="")
    plot(hclust(dist.fc, method="centroid"), hang=-1, labels=FALSE, main='Method "centroid"', sub="")
    

    更多的聚类方法和函数请参看 CRAN Task View。

    3 系统树分枝截取和簇定义

    聚类分析的目的是为了获得合适的分类。但怎么才算“合适”?这也是个大问题。典型的做法是先设定一个阈值,再使用这个阈值截取系统树,能截出几个系统树分枝就是几个簇。通过hclust类型数据截取系统树分枝分3步进行:

    • 用cutree函数截取hclust数据
    • 获取各分枝的基因名称并通过基因名称取距离矩阵的子集
    • 使用距离矩阵子集重构系统树

    后两步都很熟悉了,主要看看第1步。cutree函数参数h是我们设置的截取阈值,得到的数据是带名称的向量:元素名称是基因名,元素的值是系统树分枝编号。

    clust.fc <- hclust(dist.fc, method="complete")
    branches.fc <- cutree(clust.fc, h=0.4)
    #看看数据头的样子
    head(branches.fc)
    
    ##   254818_at   245998_at   265119_at   256114_at   254805_at 251775_s_at 
    ##           1           2           2           2           1           2
    
    #截取出的分枝和各分枝基因数
    table(branches.fc)
    
    ## branches.fc
    ##    1    2    3    4    5    6    7    8    9   10 
    ## 1960 2415 3035  845  592 1410 1655 1459 1574 1060
    

    接下来可以取距离矩阵子集并重构第系统树分枝。 你还可以在原系统树上通过画方框的方法标出各分枝:

    br1 <- names(branches.fc[branches.fc==1])
    dist.br1 <- as.dist(as.matrix(dist.fc)[br1,br1])
    clust.br1 <- hclust(dist.br1, method="complete")
    br3 <- names(branches.fc[branches.fc==3])
    dist.br3 <- as.dist(as.matrix(dist.fc)[br3,br3])
    clust.br3 <- hclust(dist.br3, method="complete")
    par(mfrow=c(1,3))
    par(mar=c(1,4,2,0))
    plot(clust.br1, hang=-1, labels=FALSE, main='branch 1', sub="")
    plot(clust.br3, hang=-1, labels=FALSE, main='branch 3', sub="")
    plot(clust.fc, hang=-1, labels=FALSE, main='clust.fc', sub="")
    rect.hclust(clust.fc, h=0.4, border="red")
    

    但从上图框出的分枝大小和前面的分枝基因数来看,各分枝并不是按图上横坐标的顺序进行排列的。

    如果你的目的是获得基因列表,那么上面的方法就可以了;如果想获得更加美观点的图形,可以将hclust产生的结果转为系统树(dendrogram)类型。系统树类型的数据也可以直接使用plot函数绘图,参数比hclust绘图更多:

    dend.fc <- as.dendrogram(clust.fc, hang=-1)
    par(mfrow=c(1,1))
    par(mar=c(2,1,1,1))
    plot(dend.fc, leaflab="none", horiz=T, edgePar = list(col="seagreen", lwd=2), main="Plot dendrogram data")
    

    而且还可以使用cut函数截取系统树。cut( )函数通过设定height参数(阈值)来截取系统树,获得的结果是列表结构,有名称为upper和lower的两个列表成员:

    cut.fc <- cut(dend.fc, h=0.4)
    class(cut.fc)
    
    ## [1] "list"
    

    再看upper和lower的类型,发现upper是系统树类型,而lower是列表。把upper系统树plot处理你就知道它是什么了:

    class(cut.fc$upper); class(cut.fc$lower);
    
    ## [1] "list"
    
    plot(cut.fc$upper, leaflab="none", horiz=T, edgePar = list(col="seagreen", lwd=2), main="cut.fc$upper")
    

    再看看lower列表,它有10个列表元素,每个都是系统树数据,我们当然也可以plot这些系统树分枝:

    cnames <- NULL
    for(i in 1:length(cut.fc$lower)) cnames <- c(cnames, (class(cut.fc$lower[[i]])))
    cnames
    
    ##  [1] "dendrogram" "dendrogram" "dendrogram" "dendrogram" "dendrogram"
    ##  [6] "dendrogram" "dendrogram" "dendrogram" "dendrogram" "dendrogram"
    
    plot(cut.fc$lower[[1]],leaflab="none", horiz=T, main="cut.fc$lower[[1]]")
    

    事实上我们可以通过另外的方法看到这10个分枝:

    plot(dend.fc, leaflab="none", horiz=T, edgePar = list(col="seagreen", lwd=2), xlim=c(0.4,0))
    

    请看cut.fc$lower1是不是就是最下面的分支?从这也可以看出cut.fc$lower中各项的排列顺序,接下来再分析各个分支就有谱了。dendrogram类型数据要获得基因名称列表还需返回到hclust数据类型,然后通过hclust的labels属性获得基因列表。因为cutree和cut函数产生的分枝编号不能对应起来,这一步很必要。

    clust.br1 <- as.hclust(cut.fc$lower[[1]])
    genes.br1 <- clust.br1$labels
    

    4 基因列表分析

    基因列表的GO和KEGG分析我们前面已经说过了,这里主要看看各簇(1-9簇)基因的表达变化趋势:

    data.fc <- as.matrix(data.fc)
    par(mfrow=c(3,3))
    par(mar=c(2,3,2,1))
    par(mgp=c(2, 0.5, 0))
    library(scales)
    color <- alpha("blue", alpha=0.1)
    for(i in 1:9){
      genes <- as.hclust(cut.fc$lower[[i]])$labels
      exprs <- data.fc[genes,]
      ylim = c(min(exprs), max(exprs))
      plot(as.vector(exprs[1,]), col=color, type='l', ylim=ylim, ylab="Expression( LogFC)", main=paste("Cluster", i))
      for(j in 2:nrow(exprs)) points(as.vector(exprs[j,]), col=color, type='l')
      box()
    }
    

    5 系统树美化及系统树、热图合并作图

    这一部分内容有些繁琐,待说。

    6 Session Info

    sessionInfo()
    
    ## R version 3.1.0 (2014-04-10)
    ## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
    ## 
    ## locale:
    ##  [1] LC_CTYPE=zh_CN.UTF-8       LC_NUMERIC=C              
    ##  [3] LC_TIME=zh_CN.UTF-8        LC_COLLATE=zh_CN.UTF-8    
    ##  [5] LC_MONETARY=zh_CN.UTF-8    LC_MESSAGES=zh_CN.UTF-8   
    ##  [7] LC_PAPER=zh_CN.UTF-8       LC_NAME=C                 
    ##  [9] LC_ADDRESS=C               LC_TELEPHONE=C            
    ## [11] LC_MEASUREMENT=zh_CN.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C       
    ## 
    ## attached base packages:
    ## [1] tcltk     stats     graphics  grDevices utils     datasets  methods  
    ## [8] base     
    ## 
    ## other attached packages:
    ## [1] scales_0.2.4 zblog_0.1.0  knitr_1.5   
    ## 
    ## loaded via a namespace (and not attached):
    ## [1] colorspace_1.2-4 evaluate_0.5.3   formatR_0.10     highr_0.3       
    ## [5] munsell_0.4.2    plyr_1.8.1       Rcpp_0.11.1      stringr_0.6.2   
    ## [9] tools_3.1.0
    

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  • 热图(heatmap)是分子生物学文章里(尤其是microarray, RNA-seq相关论文)经常出现的图片。...2)呈现多样本或多基因表达量的聚类关系。第一个很容易理解,通过使用颜色(例如红绿的深浅)来展示多个样本多个...

    热图(heatmap)是分子生物学文章里(尤其是microarray, RNA-seq相关论文)经常出现的图片。但热图一般有哪些用途,具体涉及哪些不同的参数画法,需要清楚了解。

    1. 关于热图的用途

    热图的用途一般有两个。

    以RNA-seq为例,热图可以:

    1)直观呈现多样本多个基因的全局表达量变化;

    2)呈现多样本或多基因表达量的聚类关系。

    第一个很容易理解,通过使用颜色(例如红绿的深浅)来展示多个样本多个基因的表达量高低,既直观又美观。

    第二个需要考虑:聚类的对象是什么,是否需要聚类。

    这里对典型的聚类进行举例。

    例如,下图中即对12个基因的表达量(行代表基因,右侧字符为gene ID)及48个包含正常人和病人的样本(列代表样本,下方字符为样本ID)进行聚类的结果。我们很容易观察到图中基因群及人群样本在系统关系上的分类(图边界上方及图边界左边的树形结构)。

    由此,我们从图中了解了人群样本的基因表达模式,并可以对他们进行分类。详细说来,聚类本质上利用的是多组值间两两的差异程度或者相似程度(比如欧式距离、相关系数等)作为依据,对多组值进行层级聚类,以最终得到样本间聚类的远近关系。

    aa434e4293fb579983c4282d0af2f039.png
    两组人12个基因表达的聚类图

    那么什么聚类有什么用呢?

    从样本角度讲,聚类可以观察到你采集的不同组别样本是否被分类到一起了。因为,理论上如果样本来自于同一个组,其特征应该是相似的,那么在进行聚类的时候就很容易因为相似就被聚在一起。而如果在实际操作中,某一个应该属于该组的样本被聚类到别的组了,那就说明这个样本本身的变异度很高,或者说在之前的样本采集或者测序过程中出了什么问题,则需要在正式进行接来的分析前考虑把该异常样本剔除掉。如下图如示,对照组(C)的样本聚类中出现了实验组(T),说明实验室组样本T可能有异常,需要进一步溯源其差异原因。必要情况下要予以剔除。

    00d9cbf8741d2b9d439ac6b240b1d8a9.png
    示例

    从基因表达角度讲,聚类可以观察到那些基因群具体比较一致的表达变化。因为基因的上下游关系一般是连锁反应的,也就是说一个基因的表达增加可能能够带动一系列的基因的表达增加。那么从聚类图中就可以看到这个连锁的相关性,也是就看到一群基因被聚集在了一起(如上图边界左边的树状图)。

    当你关心样本(或基因)在检测到的表达量水平如何分类,相关关系如何,那么你可以选择聚类。你可以选择:仅在样本水平聚类、仅在基因水平聚类或两者都进行。

    但并非任何时候,聚类都是最佳的选择。尤其,当你预先设定好的样本排序或基因排序已经很有生物学意义,并且想在最终的图片中呈现,就应该放弃聚类。例如,你已经按照一个代谢通路对基因排好序,只想通过热图展示这条通路上基因的表达量如何变化。因为聚类会将原来很有生物学意义的基因排列打乱了。那么选择不聚类,维持原来数据的排序就是最好的选择(如下图)

    9193f58c1495b0f4bd395a14e302563a.png
    植物生长激素代谢通路热图

    2. 热图中绘制软件和参数

    如果你对R语言有所了解,那么R软件包中的ggplots是不错的选择,ggplots 的heatmap.2 命令中的参数Rowv(行聚类)和Colv(列聚类)。如果你不懂这些编程语言,也有其他简单易用的热图绘制软件供选择,例如专栏中之前介绍的heml1.0。

    在对无论是microarray或者RNAseq进行聚类前一定要进行标准化(Normalization)。因为不进行标准化的数值有可能相互差异太大,导致热图的显示扭曲。这种标准化除了是对表达数据进行整理(比如去头去尾,保留数据群的3/4), 还包括对比如z-score变换,如下图有些microarray数据集的热图中可能会出现的图例;再比如有时候进行的log2变换。不过,这些都不会强制的,主要还是看自己数据的表达差异大不大,如果太大,就需要变换一下,使数据范围变窄一点,容易显示。

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    热图中的图例

    比如:以RNAseq为例,某低丰度的基因的表达量在RPKM<10以内。而某高丰度基因则RPKM值达到100000+。如果不对数据进行均一化,很难在同一套颜色变化幅度范围内展现如此大尺度的数值变异。而如果进行Log10变换,则分别为log10(100000)=5,log10(10)=1。此时的层次在一个量级,热图的显示也不至于太跨度太大。通常,热图软件都可以选择对绘图数值进行标准正态分布化(Z score)。也就是将一组值通过均一化,使其符合均值为0,方差为1的标准正态分布。

    对于大部分的microarray热图图例的变化范围很小,一般是以0为中心,变异范围在±3以内,这些绘图基本都是基于数据的变换后实现的。对于RNAseq而言,由于counts都是正数的,所以其热图在标准化后也还是正数,此时的图例显示一般在0-10之间。

    值得注意的是:

    在进行均一化时,我们是选择按行均一化、按列均一化还是对所有值均一化。

    • 按行均一化:将每一行数值分别单独处理,使其符合标准正态分布;
    • 按列均一化:将每一列数值分别单独处理,使其符合标准正态分布;
    • 对所有值均一化:将所有的行列数据一起处理,使其符合标准正态分布;

    不同处理方式,背后的意义也会有所不同。例如,如果在聚类过程中,你想让高表达的基因对样本的分类起到更大的作用,那么选择“对所有值均一化”也是较好的选择。但通常在热图绘制过程中,我们一般是以基因为单位来观测这些表达量数值的变化的。这意味着,这些基因无论表达量高低,其地位理论上是平等的(至少也是相似的)。即,如果A基因表达量从10变化到20,B基因表达量从100变化到200,我们更关心它们变化的倍数(都是2倍)而不是变化的绝对值(10 vs 190)。那么,我们应该以基因为单位进行归一化。

    按基因均一化,可以最大程度地呈现每一个基因的变化信息,避免一个超高表达的基因掩盖了其他基因的变化。因此,在热图绘制中,这是常用的归一化策略。

    更新于2020年8月22日

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差异基因聚类分析