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  • 蛋白质组学

    千次阅读 2012-03-11 18:36:37
    蛋白质组学 蛋白质是生物体的重要组成部分,参与几乎所有生理和细胞代谢过程。此外,与基因组学和转录组学比较,对一个细胞或组织中表达的所有蛋白质,及其修饰和相互作用的大规模研究称为蛋白质组学蛋白质组学...

    蛋白质组学
    蛋白质是生物体的重要组成部分,参与几乎所有生理和细胞代谢过程。此外,与基因组学和转录组学比较,对一个细胞或组织中表达的所有蛋白质,及其修饰和相互作用的大规模研究称为蛋白质组学。

    蛋白质组学通常被认为是在基因组学和转录组学之后,生物系统研究的下一步。然而,蛋白质组的研究远比基因组学复杂,这是由于蛋白质内在的复杂特点,如蛋白质各种各样的翻译后修饰所决定的。并且,研究基因组学的技术要比研究蛋白质组学的技术强得多,虽然在蛋白质组学研究中,质谱技术的研究已取得了一些进展。

    尽管存在方法上的挑战,蛋白质组学正在迅速发展,并且对癌症的临床诊断和疾病治疗做出了重要贡献。几项研究鉴定出了一些蛋白质在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和食道癌中表达变化。例如,通过蛋白质组学技术,人们可以在患者血液中明确鉴定出肿瘤标志物。表1列出了更多的蛋白质组学技术用于研究癌症的例子。

    另外,高尔基体功能复杂。最新研究表明,它除了参与蛋白加工外,还能参与细胞分化及细胞间信号传导的过程,并在凋亡中扮演重要角色,其功能障碍也许和肿瘤的发生、发展有某种联系。根据人类基因组研究,约1000多种人类高尔基体蛋白质中仅有500~600种得到了鉴定,建立一条关于高尔基体蛋白质组成的技术路线将有助于其功能的深入研究。

    蛋白质组学是一种有效的研究方法,特别是随着亚细胞器蛋白质组学技术的迅猛发展,使高尔基体的全面研究变为可能。因此研究人员希望能以胃癌细胞中的高尔基体为研究对象,通过亚细胞器蛋白质组学方法,建立胃癌细胞中高尔基体的蛋白质组方法学。

    研究人员采用蔗糖密度梯度的超速离心方法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳(2-DE)分离高尔基体蛋白质,用ImageMaster 2D软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立了胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。

    最后,人们根据分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,运用质谱技术鉴定出12个蛋白质,包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白和细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化、双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析,研究人员首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线。
     

    3.1 蛋白质功能预测工具[2]
    也许生物信息学方法在癌症研究中最常用的就是基因功能预测方法,但是这些数据库只存储了基因组的大约一半基因的功能。为了在微阵列资料基础上完成功能性的富集分析,基因簇的功能注解是非常重要的。近几年生物学家研发了一些基因功能预测的方法,这些方法旨在超越传统的BLAST搜索来预测基因的功能。基因功能预测可以以氨基酸序列、三级结构、与之相互作用的配体、相互作用过程或基因的表达方式为基础。其中最重要的是基于氨基酸序列的分析,因为这种方法适合于微阵列分析的全部基因。

    在表3中,前三项列举了三种同源搜索方法。FASTA方法虽然应用还不太广泛,但它要优于BLAST,或者至少相当。FASTA程序是第一个使用的数据库相似性搜索程序。为了达到较高的敏感程度,程序引用取代矩阵实行局部比对以获得最佳搜索。美国弗吉尼亚大学可以提供这项程序的地方版本,当然数据库搜索结果依赖于要搜索的数据库序列。如果最近的序列数据库版本在弗吉尼亚大学不能获得,那么就最好试一下京都大学(Kyoto University)的KEGG站点。PSI-BLAST(位点特异性反复BLAST)是BLAST的转化版本,PSI-BLAST的特色是每次用profile搜索数据库后再利用搜索的结果重新构建profile,然后用新的profile再次搜索数据库,如此反复直至没有新的结果产生为止。PSI-BLAST先用带空位的BLAST搜索数据库,将获得的序列通过多序列比对来构建第一个profile。PSI-BLAST自然地拓展了BLAST方法,能寻找蛋白质序列中的隐含模式,有研究表明这种方法可以有效地找到很多序列差异较大而结构功能相似的相关蛋白,所以它比BLAST和FASTA有更好的敏感性。PSI-BLAST服务可以在NCBI的BLAST主页上找到,还可以从NCBI的FTP服务器上下载PSI-BLAST的独立程序。在检查PSI-BLAST的搜索输出时,也有一些注意事项,因为假的匹配记录很容易污染分析结果。

     

    表3 蛋白质功能预测工具[2]

    预测工具 类型 所在地 网站
    BLAST 同源搜索 NCBI:美国国立生物技术信息中心;NIH:美国国家医学研究院 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTselect protein-protein BLAST
    FASTA 同源搜索 美国弗吉尼亚大学、日本京都大学 http://fasta.bioch.virginia.eduhttp://fasta.genome.jp/
    PSI-BLAST 同源搜索 NCBI:美国国立生物技术信息中心;NIH:美国国家医学研究院 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTselect “PSI- and PHI-BLAST”
    Pfam 蛋白质家族鉴定 华盛顿大学 http://pfam.wustl.edu
    SMART 保守结构域搜索 EMBL:欧洲分子生物学实验室 http://smart.embl-heidelberg.de
    PROSITE 功能模体搜索 瑞士生物信息研究所 http://us.expasy.org/prositehttp://motif.genome.ad.jp
    ELM 真核生物功能结构域搜索 ELM 联合体 http://elm.eu.org
    STRING 通过比较基因组学进行功能预测 EMBL(欧洲分子生物学实验室) http://string.embl.de
    PSORT 亚细胞定位预测 人类基因组中心东京大学 http://www.psort.org
    PFP 通过发掘PSI-BLAST结果进行功能预测 美国普渡大学 http://dragon.bio.purdue.edu/pfp

     

    Pfam数据库(Protein families database of alignments and HMM, 蛋白质家族比对和HMM数据库)是基于HMM模型(隐马尔可夫模型)构建并拓展起来的。它实际上是一个涵盖了生物蛋白质序列中常见结构域的序列及其相对应的隐马尔科夫模型的数据库,由英国的Sanger Institute维护。Hmmpfam的工作原理简单来说,就是将用户所提交的查询序列在Pfam库中做比对计算,然后预测出查询序列中所隐含的结构域信息。

    表4中描述的三个数据库资源——简单模块构架搜索工具(simple modular architecture research tool, SMART)、Motif数据库(PROSITE)以及 ELM是具有不同特点的数据模体数据库。SMART储存有蛋白质家族的保守区域,可以作为每一个基因家族的特征标记。SMART可以说是蛋白结构预测和功能分析的工具集合。简单点说,SMART就是集合了一些工具,可以预测蛋白的一些二级结构,如跨膜区(Transmembrane segment)、复合螺旋区(coiled coil region)、信号肽(Signal peptide)和蛋白结构域(PFAM domain)等。另一方面,PROSITE中的序列模体是一些重要的生物学位点,包括功能位点和容易被修饰的位点。ELM是真核生物功能位点数据库。

    PROSITE数据库是基于多序列比较而得到的单一保守序列片段,或称序列模体。PROSITE数据库是基于对蛋白质家族中同源序列多重序列比对得到的保守性区域,这些区域通常与生物学功能有关,例如酶的活性位点、配体或金属结合位点等。因此,PROSITE数据库实际上是蛋白质序列功能位点数据库。通过对PROSITE数据库的搜索,可判断该序列包含什么样的功能位点,从而推测其可能属于哪一个蛋白质家族。Prosite数据库实际上包括两个数据库文件:一个为数据文件,即Prosite,该文件给出了能进行匹配的序列及序列的详细信息;另一个为说明文件,即PrositeDoc。PrositeDoc说明文件中给出该序列模式的生物学功能及其文献资料来源。PROSITE数据库使用正则表达式来表示序列模式。

    STRING是一个已知和预测基因间功能联系的数据库。STRING一个有趣的特点是,一个查询序列的功能是利用比较基因组学方法预测的。例如,假设一个要查询的基因是几个基因组中功能已知的基因,这几个基因组进化上相关,那么预示着要查询的基因与相邻基因可能涉及相同的途径或功能。

    具有相同的系统发生的那些基因,或同时存在和同时消失的那些基因也预示着他们的功能是相互联系的。SMART也利用微阵列中的共表达来分析,用户可以利用SMART站点进行功能预测,基因功能之间的联系资料也可以免费获得。

    PSORT工具可以预测基因的亚细胞定位。从根本上说,PSORT工具基于其氨基酸序列预测蛋白质亚细胞定位。它利用机器将要查询蛋白质的特殊序列(如信号肽序列)检测和分类并定位到已知位置。PSORT II是广泛使用的蛋白质亚细胞定位分析软件,通过输入的氨基酸序列,能够预测出其在亚细胞结构中可能的位置。

    PFP(蛋白质功能预测)服务器是最近研发的。不同于传统的PSI-BLAST,PFP利用序列采样数可以发掘更多的功能信息。

    在列出的蛋白质功能预测工具中,BLAST、FASTA和Pfam最可靠,但它们无法提供关于已经储存在公共数据库中的已注解基因的更多的信息。其它方法都优于上述三种方法,且有更广的覆盖率,但是使用时要小心,因为有相对较高的假采样。为了避免这种情况发生,应该多采样几种方法,检查获得结果的一致性。

     

    表4 蛋白质结构预测工具
    预测工具 类型 所在地 网址
    PSIPRED 二级结构 伦敦大学 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/
    PORTER 二级结构 都柏林学院 http://distill.ucd.ie/porter/
    SAM-T02 二级结构 加州大学圣塔克鲁兹分校 http://www.cse.ucsc.edu/research/compbio/HMM-apps/T02-query.html
    SABLE 二级结构和溶剂可接近性 美国辛辛那提儿童研究基金会儿童医院医疗中心 http://sable.cchmc.org/
    PredictProtein 二级结构和其他 美国哥伦比亚大学 http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/
    COILS 2个或以上的α螺旋组成的超螺旋结构区域(卷曲螺旋区域) 瑞士,EMBnet http://www.ch.embnet.org/software/COILSform.html
    GlobPlot 无规则区域 欧洲分子生物学实验室 http://globplot.embl.de/
    PONDR 无规则区域 印地安纳大学 http://www.pondr.com/
    TMHMM 跨膜结构域 丹麦科技大学 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
    HMMTOP 跨膜结构域 匈牙利科学院 http://www.enzim.hu/hmmtop/
    SWISS-MODEL 3D结构同源建模法 瑞士生物信息研究所 http://swissmodel.expasy.org
    HHPred 3D结构同源建模法 马克斯?普朗克科学促进协会 http://protevo.eb.tuebingenmpg.de/toolkit/index.php?view=hhpred
    MODELLER 3D结构同源建模法 加州大学旧金山分校 http://salilab.org/modeller/
    FUGUE 3D结构,指认方法(线引法或穿线法) 剑桥大学 http://www-cryst.bioc.camac.uk/~fugue/
    Phyre 3D结构,指认方法(线引法或穿线法) 帝国理工学院(伦敦大学(University of London)的独立学院) http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/
    SPARKS 3D结构,指认方法(线引法或穿线法) 纽约州立大学水牛城分校 http://phyyz4.med.buffalo.edu/hzhou/anonymous-fold-sparks2.html
    Robetta 3D结构从头计算法(ab initio) 华盛顿大学 http://robetta.bakerlab.org/

     

    3.2 蛋白质结构预测工具
    当候选基因被选择出来通过微阵列进行实验检测时,生物信息学蛋白质预测工具就对设计生物化学实验非常重要。例如,一个基因预测的二级结构就对预测结构域很有益处,因为这对设计有限的蛋白质水解以鉴定基因的功能区域非常重要。当今二级结构预测算法的准确率大约75%,足以达到平常预测的要求。表4中列举了5种二级结构预测工具,它们都利用机器学习的技术来识别大家熟悉的二级结构,如α-螺旋和β-折叠。机器学习就是要使计算机能模拟人的学习行为自动通过学习获取知识和技能,不断改善性能,实现自我完善。机器学习研究的就是如何通过识别和利用现有知识来获取新知识和新技能。 PSI-PRED、PORTER、SABLE和PredictProtein seartificial利用人工神经网络(Artificial Neural Networks,简写为ANNs) ,而SAM-T02则利用HMM。 SABLE和 PORTER 被认为是这个领域中最准确的预测工具,它们的准确率分别可以达到78.4%和79%。尽管列表中的工具在蛋白质预测方面准确率还相对较低,但这些工具不仅能够预测二级结构,也能够预测其它结构信息,包括混乱区域、两个或两个以上的α螺旋组成的超螺旋结构区域、每个残基的可溶解程度以及要搜索序列的模体结构,所以他们可以用来“一步完成”蛋白质序列分析。COILS通过序列中周期出现的疏水残基来预测蛋白质的卷曲螺旋。卷曲螺旋是存在于多种天然蛋白质中的结构模式。近年来,人们通过对天然蛋白质中的卷曲螺旋结构以及根据已有知识设计合成的卷曲螺旋结构的研究,已基本掌握了这类结构模式的特点,并将特异的卷曲螺旋结构应用于生化分析、工业和医药卫生等领域。GlobPlot和PONDR是预测蛋白质固有无规则区域的工具,这些区域的天然构象中,没有稳定的蛋白质二级结构。这些无规则区域的重要性最近才刚刚被人们发现,因为它们是很多重要的功能性位点,例如其它蛋白质和配体的结合区域位于球状蛋白质的结构域的外部,所以本质上是没有规则的[3]。

    HMMTOP是预测蛋白序列的跨膜螺旋与拓扑结构工具,TMHMM是预测蛋白的跨膜螺旋工具。它们都利用了HMM。跨膜结构域预测是生物信息学在蛋白质结构预测中应用得最成功,HMMTOP预测的跨膜蛋白质98%的结构域和85%的拓扑结构是正确的。且上述这两种工具是基于网络的,HMMTOP也提供本地拷贝[3]。

    表5的后面列举了5种预测三级结构的工具。预测蛋白质三级结构的方法在最近几十年中有了较大的改进,并且有些方法的准确率已经足以应用于实践[3]。
    结构预测方法大致分为三类:
    (1) 同源性建模(homology modeling)方法:这类方法的理论依据是,如果两个蛋白质的序列比较相似,则其结构也有很大可能比较相似。有实验表明,如果序列相似性高于75%,则可以使用这种方法进行粗略的预测。这类方法的优点是准确度高,缺点是只能处理和模板库中蛋白质序列相似性较高的情况;
    (2) 从头计算(Ab initio或de novo) 方法:这类方法的依据是热力学理论,即求蛋白质能量最小的状态。生物学家和物理学家等认为从原理上讲这是影响蛋白质结构的本质因素。然而由于巨大的计算量,这种方法并不实用,目前只能计算几个氨基酸形成的结构。IBM 开发的 Blue Gene 超级计算机就是要解决这个问题;
    (3) 穿线法(Threading或fold recognition):由于 Ab Initio 方法目前只有理论上的意义,Homology方法受限于待求蛋白质必需和已知模板库中某个蛋白质有较高的序列相似性,因此对于其它大部分蛋白质来说,有必要寻求新的方法,于是Threading应运而生。

    以上三种方法中,Ab Initio方法不依赖于已知结构,其余两种则需要已知结构的协助。通常将蛋白质序列和其真实三级结构组织成模板库,待预测三级结构的蛋白质序列,则称之为查询序列(query sequence)。
    SWISS-MODEL和HHPred 是基于网络的同源建模工具,HHPred软件也可以下载。 MODELLER是这一类型软件中应用最早和最广泛的软件。MODELLER和SWISS-MODEL有同源建模数据库。接下来三个工具FUGUE、Phyre和SPARKS属于穿线法。穿线法可在数据库中搜寻和待测蛋白结构非常匹配的模板蛋白质。与同源建模法不同,穿线法中模板蛋白质和待测蛋白质明显的序列相似性并不是必要条件。穿线法可以检测一个数据库中亲缘关系很远的蛋白质,Z-score作为一个统计学值,可以显示模板蛋白质和待测蛋白之间的匹配程度,当Z-score较低时,就意味着没有匹配搜索的结构[3]。

    最后,Robetta工具属于从头计算法。它利用从数据库收集的序列片段来组装模型,是一个自动化的蛋白质结构预测服务工具。它由贝克实验室提供,用于非商业性质的从头计算和比较建模[3]。
     

    3.3 蛋白质-蛋白质相互作用数据库
    表5列出了蛋白质之间相互作用(protein-protein interactions, PPI)的数据库。在过去的几年中,有大规模实验开始研究蛋白质之间的相互作用,并且很多相关资源可以在互联网上得到。了解一个基因编码蛋白质与其它蛋白质之间的关系,对于推测这个基因发挥功能所需的背景关系具有重要意义。BIND(biomolecular interaction network database)数据库是BOND(biomolecular object network databank)数据库的一个子数据库,它是现在最大的PPI数据库。BIND数据库收录了1500种生物分子之间的200,000种相互作用的数据。这种相互作用不仅包括蛋白质之间的相互作用,还包括蛋白质与DNA、RNA、小分子、脂质以及糖类物质之间的相互作用。BIND数据库每日更新、覆盖面广,包含人、果蝇、酵母、线虫等物种的PPI[3]。

    在 BIND 数据库中,PPI 被分成 3 大类:二元分子相互作用(binary interaction) 、分 子 复 合 物(molecularcomplexe)以及生物途径(biological pathway),它们分别从不同层面呈现了分子间的相互作用关系[3]。

    DIP(database of interacting protein)数据库专门存储经实验证实的来自文献报道的二元 PPI,以及来自 PDB(protein data bank)数据库的蛋白质复合物。目前DIP收录了18,000种相互作用的数据,DIP的目的在于建立一个简单、易用、高度可信的PPI公共数据库[3]。

    MIPS(mammalian protein-protein interactiondatabase)数据库同样利用文献挖掘技术,专门存储哺乳动物的PPI,主要包括人、大鼠和小鼠等物种。该数据库详细记录了蛋白质相互作用的类型、实验证据及其结合位点。同时,它还提供蛋白质名称、实验方法和物种等多种查询方式[3]。

    HPRD(human protein reference database)数据库是包含蛋白质注释、PPI、转录后修饰和亚细胞定位等多种信息的综合数据库[3]。

    IntAct也是一个存储和分析生物分子间相互作用的公共数据库。它主要记录二元相互作用及其实验方法、实验条件和相互作用结构域,包括人、酵母、果蝇和大肠杆菌等物种。 IntAct 数据库分为基本查询和高级查询:基本查询可以根据蛋白质名称、PubMedID等进行简单搜索;高级查询根据实验方法和IntAct自定义的控制词汇进行查询。GRID存储了酵母、果蝇和线虫的遗传和生理作用。Osprey蛋白质相互作用网络可视化系统是加拿大多伦多大学一个生物信息学研究组开发的,其目的在于更好地研究蛋白质相互作用网络和蛋白质复合物[3]。

    表5 蛋白质-蛋白质相互作用数据库和数据库工具
    工具 类型 所在地 网址
    BIND 蛋白质-蛋白质相互作用途径 加拿大多伦多西乃山医院 http://bind.ca/
    DIP 蛋白质-蛋白质相互作用 加州大学洛杉矶分校 http://dip.doe-mbi.ucla.edu/
    MIPS 哺乳动物的蛋白质-蛋白质相互作用 慕尼黑蛋白质序列信息中心 http://mips.gsf.de/proj/ppi/
    HPRD 人类蛋白质参考资源 美国约翰霍普金斯大学 http://www.hprd.org/
    GRID 酵母、果蝇和线虫的遗传和生理作用 加拿大多伦多西乃山医院 http://biodata.mshri.on.ca/grid/
    IntAct 蛋白质相互作用数据库的db系统和工具的开发资源 欧洲生物信息学中心 http://www.ebi.ac.uk/intact/
    Ospray 蛋白质相互作用的可视化工具 加拿大多伦多西乃山医院 http://biodata.mshri.on.ca/osprey/

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    简介 蛋白质是生物体最终的功能执行着,其含量随着生物体的生长、环境应激反应、疾病发生发展的过程不断变化,因此,对...蛋白质组学与转录组学联合分析, 就是通过对转录组数据和和蛋白质组数据进行联合分析,挖掘mRNA

    简介

    蛋白质是生物体最终的功能执行着,其含量随着生物体的生长、环境应激反应、疾病发生发展的过程不断变化,因此,对蛋白质的解析意义重大。转录组是连接基因组和蛋白质组的中间模块,从DNA转录成mRNA,再翻译成蛋白质的过程中,涉及到一整套精细的表达调控机制,如转录调控,转录后调控,翻译调控,翻译后调控等。研究表明转录组和蛋白质组的相关系数并不高,表明在这个过程中,翻译和翻译后调控对蛋白质的表达具有非常重要的调控作用。

    蛋白质组学与转录组学联合分析, 就是通过对转录组数据和和蛋白质组数据进行联合分析,挖掘mRNA与蛋白的表达水平,充分利用转录组和蛋白质组研究的差异性和互补性,对基因的表达水平进行全方位的衡量,以获得基因表达各个步骤表达和调控的全景图,发掘常规单个组学未能发现的新结果。全面探究生物体疾病机理,生长发育机制等。

    蛋白质组学与转录组学联合分析一般分析流程
    在这里插入图片描述
    主要分析内容

    • 定性关联分析
    • 共有基因分析
    • 转录组与蛋白组定量关联分析。
    • mRNA与蛋白表达趋势一致的基因pathway分析。
    • mRNA与蛋白表达趋势相反的基因pathway分析。
    • 蛋白表达无变化,对差异表达mRNA对应的基因进行pathway分析。
    • mRNA表达无变化,对差异表达蛋白对应的基因进行pathway分析。
    • 转录组与蛋白组表达模式分析。
    • 蛋白相互作用网络分析。

    应用示例

    人类结肠癌的蛋白基因组分析揭示了新的治疗机会

    Proteogenomic Analysis of Human Colon Cancer Reveals New Therapeutic Opportunities
    文章链接 https://www.sci-hub.ren/10.1016/j.cell.2019.03.030
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    蛋白组学与多组学联合分析,揭示Rb的磷酸化与结肠癌的进程密切相关并可作为治疗靶点
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    本篇介绍下蛋白质组学,如果覆盖度深的话,应该是新时代的宠儿了。 古希腊,一个神一样的存在,不只有雅典娜,更孕育了“ome”等一批高大上的词汇。组学表示一组物质整体的表现。蛋白质组学表示特定系统内蛋白质...

    作者简介:中科院遗传与发育生物学研究所中丹学院博士生张泽宇,外号 “大神”,口号 “Now you see me”。

    这是其刚入学时做的一个报告。

    本篇介绍下蛋白质组学,如果覆盖度深的话,应该是新时代的宠儿了。

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    古希腊,一个神一样的存在,不只有雅典娜,更孕育了“ome”等一批高大上的词汇。组学表示一组物质整体的表现。蛋白质组学表示特定系统内蛋白质集合的研究。

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    蛋白质组学有基于二维凝胶分离 (2D-Gel)和质谱鉴定技术。

    image

    2D-Gel根据蛋白的等电点和分子质量的差异,通过等点聚焦和SDS-PAGE分离,通过染色和成像把不同电性和大小的蛋白质显示在凝胶上。

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    点的密度、大小、位置不同可以定性查看有无和相对定量地查看丰度差异。

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    chromatography 层析、色谱,(graphy也来源于希腊文,意为写)。携带样品的流动相穿过固定相时,由于样品各组分理化性质存在差异,与固定相作用力弱的组分,移动速度快;反之,移动速度慢。根据不同的保留时间,收集特定属性的样品进行进一步分析。根据流动相的不同又分为气相色谱和液相色谱。

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    高效液相色谱,又称为高压液相色谱,高速液相色谱。流动相为液体,在高压作用下快速流过固定相,分离效能高,灵敏度高,应用范围广,柱子可反复使用。最早洗脱出的是越亲水的。

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    质谱是测量离子质荷比的分析方法,基本原理是使待测样品中的组分在离子源中离子化,经过电场加速形成离子束,进入质量分析器,获得质谱图。与Uniprot数据库比较,得到对应的蛋白定量。

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    常用离子源有:基质辅助激光解吸电离(MALDI);电喷雾电离(ESI)。

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    飞行时间质谱 (TOF),分析物的质荷比是根据分析物在真空飞行管中的飞行时间推算出的。飞行时间质谱的质量分析器由调制区、加速区、无场飞行空间和检测器等部分组成。样品分子电离以后,将离子加速并通过一个无场区,不同质量的离子具有不同的能量,通过无场区的飞行时间长短不同,可以依次被收集检测出来。

    四极杆 (Quadrupole,Q)质谱仪,从单级四极杆到三级四极杆, 功能越来越强。第一级四极杆选母离子,第二级四极杆作为碰撞室对母离子进行碰撞解离,第三级四极杆作为质量分析器完成离子分析。三级四极杆采集到的MS/MS质谱图信息量大,并且较少发生重排反应,因而四极杆的质谱数据质量要高于离子阱串联质谱数据。

    离子阱 (Orbitrap)质谱仪,串联质谱仪,在分析前先将离子聚集储存,离子阱是该仪器的核心部分,既可以作为碰撞室,又可以作为质量分析器。分为线性离子阱和三维离子阱。线性离子阱具有更大的离子容量和扫描速度。

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    蛋白质组实验流程文字和图形总结

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    定性蛋白质组学

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    从样品中分析全蛋白,胰蛋白酶消化成多肽,经液相色谱-质谱检测,比较实际检测到的质荷比和理论预测的质荷比,鉴定蛋白的种类。

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    离子的属性和质量不同会产生不同的质量指纹图谱。

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    若多肽的氨基酸组成一样,但顺序不同,如何区分?

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    串联质谱,先获得小肽的质量;再将肽离子诱导碰撞碎裂成更小的碎片离子,获得二级质谱图谱。

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    不同的片段化方式会得到不同的片段

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    MASCOT软件搜库鉴定蛋白

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    鉴定蛋白翻译后修饰

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    磷酸化肽段富集 (类比于ChIP中的富集和Input)

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    定量蛋白质组学

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    Label free相对定量,蛋白的量与Peak强度正相关。

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    酶解标记法, 酶解时加入H218O,可以在肽段C端加2个重氧原子。

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    iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,而后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

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    SILAC: 两组细胞同时培养,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。最初SILAC使用的标记氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸,目前常用的标记氨基酸有亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。细胞传代若干代后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中,取代了原有的氨基酸。这样,两个蛋白之间就存在分子量的改变,而其它化学性质无异。

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    现存技术的缺点

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    靶向蛋白质组技术主要包括SRM/MRM和PRM两种方法。SRM/MRM (Selected/ Multiple reaction monitoring)使用的是三重四级杆的质谱,利用四级杆高选择性的特点对母离子和子离子依次进行分选。

    PRM(Parallel reaction monitoring)技术,该技术结合了四级杆的高选择性以及Orbitrap的高分辨、高精度特性,能够对二级图谱进行独立的鉴定,方法流程更加便捷。与传统的SRM/MRM相比,PRM在复杂背景下具有更优秀的抗干扰能力和检测灵敏度。

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    同源搜索或结合转录组数据解决注释缺失的问题

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    总结

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    Ref:

    1. http://www.360doc.com/content/15/0529/20/11644963_474287763.shtml

    2. http://tech.sina.com.cn/roll/2017-06-05/doc-ifyfuzym8006769.shtml

    3. https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-mass-spectrometry-analysis/protein-quantitation-mass-spectrometry/silac-metabolic-labeling-systems.html

    4. https://baike.baidu.com/item/%E5%90%8C%E4%BD%8D%E7%B4%A0%E6%A0%87%E8%AE%B0%E7%9B%B8%E5%AF%B9%E5%92%8C%E7%BB%9D%E5%AF%B9%E5%AE%9A%E9%87%8F/12756990?fr=aladdin&fromid=347038&fromtitle=iTRAQ

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蛋白质组学