精华内容
下载资源
问答
  • 测序原理

    2018-11-20 16:08:00
    1. 高通量测序(highthroughput sequencing, HTS)/下一代测序(next generation sequencing, NGS)前世今生 ref:https://baijiahao.baidu.com/s?id=1612934763948082306&wfr=spider&for=pc 共有三代HTS方法...

    1. 高通量测序(highthroughput sequencing, HTS)/下一代测序(next generation sequencing, NGS)前世今生

    ref: https://baijiahao.baidu.com/s?id=1612934763948082306&wfr=spider&for=pc

    共有三代HTS方法,

    第一代:Sanger测序(已淘汰)

      双脱氧核苷酸末端终止法。引物结合模板/sample, DNsae延伸引物,掺入ddNTP在每一个base位置终止链反应,拼接不同长度合成序列得到所有序列

      缺点:慢

      衍生:鸟枪法。打断长DNA成若干短片段,分别对每个短片段sanger测序从而大大节约时间

    第二代:Roche 454焦磷酸测序,Illumina Solexa测序,ABI SOLID测序 (目前主流)

      目前主要使用Illumina Solexa测序。“sequencing by synthesis”通过合成进行测序(De novo sequencing)。先"加adapter使目的片段与flowcell连接->PCR扩增目的片段(fluo-tag dNTP)->酶消化反义链只留原始目的片段,得到荧光标记目的片段簇->detect fluorescence(i.e.sequencing)

    第三代:单分子实时DNA测序(no PCR, 尚未广泛应用)

      单分子荧光测序(边合成边测序);纳米孔测序(电信号)

    2.单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)的关系

    ref:https://blog.csdn.net/hanli1992/article/details/82982434

    main difference : construct sequencing library(接adapter方法不同)

    Single end:

      

      碎片化DNA->加sequencing primer(SP1)至片段一端后,两端加adapter(A1,A2)->利用adapter将碎片化目的片段固定于flowcell生成DNA簇(2链由于PCR与1链配对故而扩增的2链有SP1识别位点)->由于SP1测序方向的设计,只有2链会被sequencing而1链不会被测序

      “adapter有一对但SP只有一个,一次测序”

    pair end:

      

      与SE类似,但“adapter和SP都有一对,分别连在DNA两条链两个方向上,两次测序”

      先测2链->去除2链->用对读测序模块(Paired-End Module)引导2链互补链在原位置再生和扩增形成1链DNA簇->1链测序

    3.call mutation去重

    mutation来源:cell本身(我们真正想要得到的真实mutation)+ 碎片化DNA时引入error1 + PCR扩增error2

    细胞量不足或者提取DNA时发生降解都可能造成局部DNA浓度低,直接测序有可能损失该部分微量DNA,故而使用PCR扩增。

    PCR扩增产生的重复序列可能造成mutation calling 的不准确:

      (1)假阳性变异:原本量很多的DNA通过PCR更多了,故取样测序时可能被重复取样从而产生测序重复序列,这样error1&error2都被放大

      (2)假阴性变异:由于PCR Bias(PCR可能倾向于更多扩增含有某一碱基的DNA片段),若这个片段恰巧是call mutation用的reference片段上的碱基,那么reference信号的增强也意味着mutation信号的减弱,从而被误判为不重要的mutation

    GATK、Samtools、Platpus等这种利用贝叶斯原理的变异检测算法都是认为所用的序列数据都不是重复序列(即将它们和其他序列一视同仁地进行变异的判断,所以带来误导),因此必须要进行标记(去除)或者使用PCR-Free的测序方案(这种方案目前正变得越来越流行,特别是对于RNA-Seq来说尤为重要,现在著名的基因组学研究所——Broad Institute,基本都是使用PCR-Free的测序方案)

      这也提醒我们用这些软件时要记得remove duplicate

     

    转载于:https://www.cnblogs.com/xiaoxiaoxiaoxue/p/9989549.html

    展开全文
  • 二代测序原理(Illumina)

    万次阅读 多人点赞 2019-10-12 18:27:44
    虽然三代测序现在已经商用,但是目前的主流还是二代...0、 基本原理 基于可逆终止的,荧光标记dNTP,做边合成边测序 分为三步: 样本准备 Sample Prep 成簇 Cluster Generation 测序 Sequencing 数据分析 Data Anal...

    虽然三代测序现在已经商用,但是目前的主流还是二代测序,尤其是Illumina公司的测序方式更是大行其道。那么,下面我们从四个方面来说说illumina家的二代测序是怎么得到的生物数据。

    0、 基本原理

    基于可逆终止的,荧光标记dNTP,做边合成边测序
    分为三步:

    • 样本准备 Sample Prep
    • 成簇 Cluster Generation
    • 测序 Sequencing

    1、样本准备 Sample Prep

    通过不同实验方法得到的样品,需要先提取样本基因组中的DNA,用超声波将其随机打断。然后使用酶将两端补平,使用 Klenow 酶在3‘ 端加一个 A 碱基(用于连接接头序列)。为了后续扩增,测序分析,需要为这些DNA片段添加特定的接头序列。接头序列是已知的,大概有三种:

    mark

    • sequencing binding site(绿)
    • index(红,黄)
    • 流动池引物互补的序列(蓝,紫)

    添加完接头序列后的DNA片段集合叫DNA文库 (DNA library),这样就完成了样品准备工作。

    2、成簇 Cluster Generation

    成簇是DNA片段被扩增的过程,该过程在流动池 (Flowcell) 中完成。它是一片带有8条通道(lanes)的玻璃载玻,每个通道内表面附有两种DNA引物。

    mark

    首先,引物会与样品中的DNA片段的接头序列互补配对,固定在通道表面

    mark

    通过聚合酶生成杂交片段的互补片段,然后加入NaOH碱溶液后,双链分子变性,原始模板链(左边的链)被流动池中的液体洗去

    mark

    加入中性液体用于中和碱溶液,剩下的单链拷贝链另一端的接头就会与通道表面的引物结合,形成单链桥。

    mark

    同样的,在聚合酶参与下,生成互补链,最终形成双链桥

    mark

    通过变性,DNA分子线性化,变为两个单链拷贝

    mark

    它们又分别与自己配对的引物结合

    mark

    重复这个循环,同时形成数百万的簇。在这个过程中,所有的DNA片段都会被克隆扩增。

    mark
    桥式扩增后,反向链会被切断洗去,仅留下正向链。为防止特异性结合重新形成单链桥,3‘端被封锁

    mark

    3、测序 Sequencing

    首先,在Flowcell中加入荧光标记的dNTP和酶,由引物起始开始合成子链。但是dNTP存在 3’端叠氮基会阻碍子链延伸,这使得每个循环只能测得一个碱基。合成完一个碱基后, Flowcell 通入液体洗掉多余的dNTP和酶,使用显微镜的激光扫描特征荧光信号。

    mark

    荧光发射波长与信号强度一起决定了碱基的读出,所有的DNA片段的一个碱基会被同时读取。在大规模并行的过程中,机器读取的图像类似下面这样

    mark

    加入化学试剂将叠氮基团与荧光基团切除,然后 Flowcell 再通入荧光标记的dNTP和酶,由引物起始开始合成一个碱基。不断重复这个过程,完成第一次读取。

    由于测序仪每次测序时的通量比较大,所以每次测得的序列可能不止一个样本。为了去区分每个样本及正负链,科学家构建DNA文库时,在接头序列加入了的不同 index(或 barcode)来区分来源。

    首先,在完成第一次读取后,复制出的链会被洗去

    mark

    index 片段引物被引入并与模板杂交,完成序列读取后被洗去。这样读取到的序列与开始时已知的index比对后就可以给测得的序列贴上标签,方便后续分析。

    mark

    Paired-end测序已经是现在的主流,它提高了测序长度的同时,又可以为结构变异分析提供新方法。要完成双末端测序,首先要将模板链3’去保护,模板折叠,index片段引入

    mark

    在聚合酶参与下形成双链桥

    mark

    然后变性,恢复为单链。注意,这次是将正向链切除并洗去,只留下反向链

    mark

    反向链以测序引物为起始,与正向链类似,经过多个循环后完成读取。

    mark

    数据分析 Data Analysis

    测序完成后会产生数百万个 reads,基于在样品准备时构建的 index 分类来自不同样本的序列。对于每个样品来说,具有相似延伸的碱基被聚在一起。正向和反向read配对生成连续序列。这些序列通过与参考基因组匹配后,实现完整序列的构建。


    其他测序技术

    一代测序原理 (Sanger 法)

    二代测序原理(Illumina)

    三代测序原理(SMRT Sequencing)

    三代测序原理(Nanopore)

    ChIPseq 测序原理

    BS-seq 测序原理

    Hi-C 测序原理

    组蛋白修饰

    三维基因组

    展开全文
  • Solexa测序原理及实验流程 Solexa, 流程, 原理, 实验Illumina 公司的Solexa 测序技术为广大用户提供了强大的高通量测序方法上海伯豪生物技术有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心SBC利用Solexa系统为目前遗传分析...
  • 大数据基因组测序原理与方法.ppt
  • 测序原理及疑问总结

    2021-07-19 13:30:14
    1.测序原理 2.测序深度与覆盖率问题 概念及常规总结 link

    1.系统归纳

    1. 测序原理
      illumina
      在这里插入图片描述
      2.illumina测序梳理
      参考:pythonic 生物人

    2.概念

    1. 测序深度与覆盖率问题

      1. 概念及常规总结
        link
      2. 计算
        link
    2. 去冗余
      1.生物中的冗余现象:剩余储备
      link

      2.去冗余的原因:
      为什么要去冗余?link
      因为原始序列几百万条,聚类计算的时间极其恐怖。而已知扩增子测序结果中序列重复度高,并且大量出现1次或几次的序列统计学和功能上意义不大。因此将几百万条序列去冗余,并过滤低丰度序列,一般只剩几万条,极大的减少了下游分析的工作量,并可使结果更容易理解。

      1. 方法:即对数据框取子集 link
        1)坐标
        2)列名
        3)逻辑判断
    > pd <- data.frame(1:10,4,7,3,'a','d',
     1.               LETTERS[1:10],letters[1:10],
     2.               c(rep('a',5),rep('b',5)))
    > pd
       X1.10 X4 X7 X3 X.a. X.d. LETTERS.1.10. letters.1.10. c.rep..a...5...rep..b...5..
    1      1  4  7  3    a    d             A             a                           a
    2      2  4  7  3    a    d             B             b                           a
    3      3  4  7  3    a    d             C             c                           a
    4      4  4  7  3    a    d             D             d                           a
    5      5  4  7  3    a    d             E             e                           a
    6      6  4  7  3    a    d             F             f                           b
    7      7  4  7  3    a    d             G             g                           b
    8      8  4  7  3    a    d             H             h                           b
    9      9  4  7  3    a    d             I             i                           b
    10    10  4  7  3    a    d             J             j                           b
    > ?apply
    > apply(pd,2,function(x){
     3.            length(unique(x))>1})
                          X1.10                          X4                          X7 
                           TRUE                       FALSE                       FALSE 
                             X3                        X.a.                        X.d. 
                          FALSE                       FALSE                       FALSE 
                  LETTERS.1.10.               letters.1.10. c.rep..a...5...rep..b...5.. 
                           TRUE                        TRUE                        TRUE 
    > d <- apply(pd,2,function(x){
     4.            length(unique(x))>1})
    > pd[,d]
       X1.10 LETTERS.1.10. letters.1.10. c.rep..a...5...rep..b...5..
    1      1             A             a                           a
    2      2             B             b                           a
    3      3             C             c                           a
    4      4             D             d                           a
    5      5             E             e                           a
    6      6             F             f                           b
    7      7             G             g                           b
    8      8             H             h                           b
    9      9             I             i                           b
    10    10             J             j                           b
    

    3.FASTA & FASTQ

    1. FASTA :人为生成的序列文件
    2. FASTQ :测序仪输出的序列文件
      link

    4.barcode & UMI

    1. barcode:单个细胞标记
    2. UMI:对原始样本基因组打断后的每一个片段分子标记
      单细胞测序中的标签:barcode&UMI

    5 .BAM&SAM
    SAM/BAM注释及相关基本概念

    3.常见问题分析

    1. 摘录别人常见问题:
      duplicate等

    4.单细胞测序相关文献

    8篇文献

    展开全文
  • 测序原理:边合成边测序 测序特点: 1. 四色荧光基团 分别将四色荧光基团标记在脱氧核苷酸的磷酸基团的末端。当碱基配对完成之后,随着磷酸基团的掉落而掉落,并且不会影响后续的测序过程。 2.Zero Model ...

    测序原理:边合成边测序

    测序特点:

    1. 四色荧光基团

    分别将四色荧光基团标记在脱氧核苷酸的磷酸基团的末端。当碱基配对完成之后,随着磷酸基团的掉落而掉落,并且不会影响后续的测序过程。

    2.Zero Model Waveguide(ZMW) 70mm 直径的测序微孔

    在测序微孔中,聚合酶存在于玻璃板的底部,当聚合酶抓住一个dNTP的时候,会停留一段时间,这时激发波长才会激发基团发出荧光,而孔中其他少量的游离dNTP则不会被激发。

    3.Pacbio 哑铃状文库

    DNA分子被接上发卡状的adaptor,因此,构建的文库整个是圆环的分子,利于其周而复始的复制。并且,对于一个片段的重复测序,可以提高准确度,因为不会像illumina测序那样,因为同时测多个碱基而出现phasing 和prephasing的情况,制造噪音限制读长。

    4.Pacbio 测序读长长的原因

    就是因为只有一个分子,不会容易出现噪音。

    5.缺点

    对碱基的判断会出现随机误差,错误率大概是12.5%,但是这种错误可以通过对DNA分子对进行几次测序进行弥补。    

    6.   限制读长的因素

    光照条件下,DNA链可能会出现缺口。

    光照条件下,聚合酶可能会变性

    文库本身的长度不够,因为建立一个DNA文库,长度>20kb-30kb的文库是有困难的。

    7.   Pacbio 的测序通量

    每张芯片0.3-0.4G数据

    测序复合物:包括聚合酶、测序模板,测序引物。在聚合酶上加上生物素,在玻璃板上加上链霉亲和素,将聚合酶固定在玻璃板的底部。芯片上的小孔是随机加入测序复合物的,一张芯片15万个空,其中1/3的小孔是含有一个测序复合物,1/3的小孔是空的,剩下的1/3含有2-3个测序复合物。(根据泊松分布)。空的不会产生信号,而多个测序复合物会产生杂乱的信号,都会失去作用。因此有效的孔数是5万个,每个平均测序长度是8000个碱基,因此平均每张芯片的测序数据量是0.3-0.4G的产出。

    8.Pacbio 可以直接测到被修饰的DNA碱基

    因为聚合物遇到模板上被修饰的碱基,例如甲基化的碱基,合成的速度明显被放慢,并且广谱特征也发生改变。这样就可以判断该位置的DNA被甲基化了。

    9.GC bias

    Pacbio的GC bias很小。例如,在PCR过程中,如果模板的GC含量比较高,那么PCR的效率就会比较低。反之,AT含量高,PCR的效率就会高,而传统的建库过程中,PCR的过程比较多,导致的结果就是GC含量高的reads数就会比较差。而Pacbio不是传统的建库方法,其GC bias明显小于PCR建库的illumina或Ion Torrent的测序结果。

    10.测序速度

    Pacbio的聚合酶可以1s钟合成3个碱基,1小时就是合成1万多个碱基。3个小时就是3万多个碱基,而之后,继续在读的reads数,已经几乎没有了,因此3小时之后基本完成测序。

    相对illumina的测序速度,是非常快的,也比Ion Torrent的测序速度也是快一点点的。国内测序的Pacbio大概10-20台。


     

    展开全文
  • 1. 一代二代测序原理视频 2. 三代测序原理
  • 二代测序原理与技术(IonProton)
  • NGS基础 - 高通量测序原理 原创:赑屃生信宝典2017-07-23 NGS系列文章包括NGS基础、转录组分析、ChIP-seq分析、DNA甲基化分析、重测序分析五部分内容。 NGS基础系列文章包括高通量测序原理,测序数据获取和...
  • 针对PacBio单分子测序——第三代测序技术的测序原理和读长 DNA基因测序技术从上世纪70年代起,历经三代技术后,目前已发展成为一项相对成熟的生物产业。测序技术的应用也扩展到了...
  • Pacbio测序原理及SMRT bell文库构建流程简述(二)​mp.weixin.qq.com大家好,今天跟大家继续分享关于PacBio SMRT测序仪的相关知识,分享内容主要参考PB官方的《Template Preparation and Sequencing Guide》并以PPT...
  • Illumina平台测序原理–详细而易懂

    千次阅读 2019-10-11 14:12:56
    Illumina平台测序原理–详细而易懂 转载:https://wenku.baidu.com/view/ea7894faddccda38376baff3.html?pn=50
  • NGS基础——高通量测序原理 本文介绍了测序文库构建原理、链特异性文库构建方式和识别方法、测序簇生成过程、双端测序过程、测序接头产生、PCR duplicate、测序通量选择标准等。原文都是一张张PPT,截图下来之后,附...
  • 三代测序原理与数据文件简介(SMRT+Nanopore) 一生雾梦2019-12-03 20:48:421578收藏2 分类专栏:前沿文献分析文章标签:三代测序(SMS)SMRTNanopore生物信息测序原理 版权 Pacific Biosciences单分子实时...
  • 一代测序原理 (Sanger法测序)

    千次阅读 2020-03-08 17:50:32
    Sanger 测序原理 构建反应系统 Sanger法测序由一套四个单独的反应构成,每个反应系统包含 四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP),可以正常合成DNA 每个反应系统加入四种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP),由于ddNTP缺乏...
  • SOLiD测序原理及实验流程

    万次阅读 2014-10-29 14:53:09
    SOLiD测序原理及实验流程     SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列,随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列,把SOLiD颜色序列定位到reference...
  • illumina测序原理

    2017-08-01 21:47:00
    是指Illumina测序时,测序反应发生的位置,1个flowcell含有8条lane lane通道 每一个flowcell上都有8条泳道,用于测序反应,可以添加试剂,洗脱等等 tile 每一次测序荧光扫描的最小单位 reads 指测序的结果,1...
  • 微生物多样性测序原理及案例解析 研究对象 人类:口腔、皮肤、粪便、肠道... 动物:瘤胃、肠道… 植物:菌根、内生菌... 历代测序原理 一代测序 双脱氧链终止法 正常的DNA碱基是四种脱氧核糖...
  • 基本概念: 第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time (SMRT™) ... SMRT测序原理 步骤1:将磷酸化核苷酸引入零模波导孔(ZMW) 步骤2:核苷酸在检测体积中保持数十毫秒,当被光激发时发出荧光。 捕获
  • 2020.09.15丨细菌&真菌基因组测序原理

    千次阅读 2020-09-15 16:57:40
    细菌基因组测序原理 细菌定义: 属于原核生物,无核膜、DNA裸露,分真细菌和古细菌两大类的微生物。是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体,是大自然物质循环的主要参与者。 细菌基因组特点: 基因组:...
  • 测序原理一些知识点

    2021-03-19 21:33:49
    详细链接 https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684
  • 参考: 独占鳌头的Illumina仪器(二代测序篇) HiSeq2000测序原理、流程与仪器 NGS文库制备的方法比较[心得点评] 各种测序文库构建方式 样本:就是待测的DNA、RNA或蛋白序列,样本来源单一的就是单样本,样本来源于多...
  • 对DNA测序本质上就是识别ATCG四种碱基,但是一方面四种碱基实在太小了,属于纳米级别,另一方面嘌呤和嘌呤,嘧啶和嘧啶之间化学结构非常相似,不容易区分。从53年提出DNA双螺旋结构之后,生物学家一直努力通过各种...
  • NGS系列文章包括NGS基础、转录组分析 (Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这)、ChIP-seq分析 (ChIP-seq基本分析流程)、单细胞测序分析 (重磅综述...
  • 写在前面:PacBio公司主要有两个测序平台一个是RS,一个是最新的Sequel,下面如果没有指明则是在讲RS平台。 SMRT测序技术总览(SMRT® Sequencing Technology Overview) 首先必须对下面几个东西形成概念: 1.SMRT ...
  • 测序原理的过程是如何进行?

    千次阅读 2018-04-18 12:27:07
    1.Cluster Generation2.Linearization3.Reverse stand cleavage4.Blocking5.Read 1 Primer ...

空空如也

空空如也

1 2 3 4 5 ... 20
收藏数 2,487
精华内容 994
关键字:

测序原理